在現(xiàn)代生物學(xué)研究中，CRISPR/Cas9 技術(shù)為構(gòu)建基因敲除小鼠提供了高效精準(zhǔn)的手段。以下是運(yùn)用該技術(shù)構(gòu)建基因敲除小鼠的詳細(xì)實(shí)驗(yàn)流程：

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1、目標(biāo)基因的選擇與 sgRNA 設(shè)計(jì)

• 靶基因分析：首先要確定目標(biāo)基因，著重挑選其外顯子區(qū)域，一般優(yōu)先選取早期外顯子，這樣能有效提高基因敲除的成功率。
• sgRNA 設(shè)計(jì)：借助專業(yè)的在線工具，像 CRISPR Design、Benchling、CRISPOR 等來(lái)精心設(shè)計(jì)靶向目標(biāo)序列的 sgRNA。設(shè)計(jì)時(shí)要嚴(yán)格把關(guān)，篩選出高特異性的 sgRNA，盡可能避免脫靶現(xiàn)象，其長(zhǎng)度通常固定為 20bp。與此同時(shí)，Cas9 的選擇也不容忽視，一般常用來(lái)源于化膿鏈球菌的 SpCas9，并且要保證它與所選的 sgRNA 能夠完美兼容。另外，如果實(shí)驗(yàn)需要引入特定突變或者大片段缺失，那就得著手設(shè)計(jì)同源重組修復(fù)模板（HDR 模板）。

2、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇

• 小鼠品系：實(shí)驗(yàn)常選用 C57BL/6 或者 FVB/N 等品系的受精卵，而且要選取處于原核期的胚胎。這些品系的小鼠在遺傳學(xué)研究領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，能為實(shí)驗(yàn)提供穩(wěn)定可靠的基礎(chǔ)。
• 動(dòng)物倫理：整個(gè)實(shí)驗(yàn)必須通過(guò)倫理委員會(huì)的嚴(yán)格審批，確保實(shí)驗(yàn)過(guò)程遵循動(dòng)物福利原則，不對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物造成不必要的傷害。

實(shí)驗(yàn)材料制備

1、體外轉(zhuǎn)錄或合成 CRISPR 組件

• sgRNA 合成：可以通過(guò)化學(xué)合成的方式，也可以采用體外轉(zhuǎn)錄法。若選擇體外轉(zhuǎn)錄，務(wù)必添加 T7 啟動(dòng)子以及 sgRNA 骨架，以此保障 sgRNA 的正常合成與后續(xù)功能發(fā)揮。
• Cas9 mRNA 制備：同樣采用體外轉(zhuǎn)錄的方法來(lái)制備 Cas9 mRNA，過(guò)程中要添加 5' 帽結(jié)構(gòu)以及 polyA 尾，這對(duì)提高 Cas9 mRNA 的穩(wěn)定性至關(guān)重要，能確保它在后續(xù)實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)中穩(wěn)定發(fā)揮作用。
• 純化：完成 sgRNA 和 Cas9 mRNA 的制備后，要對(duì)它們進(jìn)行精細(xì)純化，去除可能存在的雜質(zhì)。因?yàn)殡s質(zhì)一旦混入，極有可能影響后續(xù)胚胎的存活率，干擾實(shí)驗(yàn)進(jìn)程。

2、顯微注射混合液配制

將 sgRNA 按照 50 - 100ng/μL 的濃度、Cas9 mRNA 以 100 - 200ng/μL 的濃度，一同混合于顯微注射緩沖液中，常用的是 RNase - free TE 緩沖液。倘若實(shí)驗(yàn)用到了 HDR 模板，還需依據(jù)具體實(shí)驗(yàn)需求，準(zhǔn)確加入線性化質(zhì)粒或 ssDNA，并合理調(diào)整其濃度。

受精卵的獲取與顯微注射

1、超排卵與受精卵采集

• 超排卵：對(duì)雌性小鼠注射孕馬血清促性腺激素（PMSG），間隔 48 小時(shí)后，再注射人絨毛膜促性腺激素（hCG），以此刺激雌鼠超排卵，為后續(xù)獲取充足的受精卵創(chuàng)造條件。
• 交配：將完成超排卵處理的雌鼠與雄鼠合籠，之后仔細(xì)檢查雌鼠陰栓情況，以此確認(rèn)受精卵是否處于原核期，正常情況下受精后約 0.5 天受精卵會(huì)處于該關(guān)鍵時(shí)期。
• 受精卵收集：確認(rèn)受精卵狀態(tài)后，處死雌鼠，小心沖洗其輸卵管，從中精準(zhǔn)收集處于原核期的受精卵，這些受精卵將作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的核心材料。

2、顯微注射

• 顯微操作：運(yùn)用專業(yè)的顯微注射儀，將預(yù)先配制好的 CRISPR 混合液（包含 sgRNA、Cas9 mRNA，如有需要還包括 HDR 模板）精準(zhǔn)注入受精卵的原核或者細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。這一步操作對(duì)技術(shù)要求極高，需要操作人員具備精湛的顯微操作技能。
• 胚胎培養(yǎng)：完成顯微注射后的胚胎，要在適宜的體外環(huán)境中培養(yǎng)，直至發(fā)育到兩細(xì)胞期或者囊胚期，這個(gè)過(guò)程大約需要 24 小時(shí)。在此期間，要嚴(yán)格把控培養(yǎng)條件，確保胚胎能夠正常生長(zhǎng)發(fā)育。

胚胎移植與代孕母鼠

1、代孕母鼠準(zhǔn)備

通過(guò)讓結(jié)扎雄鼠與雌鼠交配，誘導(dǎo)雌鼠產(chǎn)生假孕狀態(tài)，這些代孕母鼠將作為胚胎移植的受體，為后續(xù)植入胚胎提供孕育環(huán)境。

2、胚胎移植

依據(jù)胚胎發(fā)育所處的階段，將培養(yǎng)好的胚胎準(zhǔn)確移植到代孕母鼠相應(yīng)的部位，若是兩細(xì)胞期胚胎，一般移植到輸卵管；若已發(fā)育至囊胚期，則移植到子宮。為提高妊娠成功率，通常每只母鼠會(huì)移植 10 - 15 枚胚胎。

子代小鼠鑒定

1、F0 代小鼠基因型分析

樣本采集：待子代小鼠出生大約 3 周后，小心剪取其尾巴，以此提取基因組 DNA，作為后續(xù)基因型分析的樣本。

PCR 擴(kuò)增靶區(qū)域：專門(mén)設(shè)計(jì)能夠擴(kuò)增 sgRNA 靶點(diǎn)附近區(qū)域的引物，利用 PCR 技術(shù)對(duì)樣本 DNA 進(jìn)行擴(kuò)增，獲取足量的靶區(qū)域 DNA 片段用于后續(xù)檢測(cè)。

檢測(cè)方法：

• TA 克隆測(cè)序：將 PCR 產(chǎn)物進(jìn)行克隆處理，之后測(cè)序分析，通過(guò)這種方式能夠精準(zhǔn)檢測(cè)出插入 / 缺失（Indel）突變情況，為判斷基因敲除效果提供直接依據(jù)。
• T7E1 或 Surveyor 酶切：這種方法主要用于快速篩查，通過(guò)檢測(cè)雙鏈 DNA 錯(cuò)配情況，初步判斷基因是否發(fā)生突變，能在短時(shí)間內(nèi)處理大量樣本，提高篩選效率。
• 高通量測(cè)序（NGS）：該技術(shù)能夠精確解析突變類(lèi)型，同時(shí)還能深入分析是否存在脫靶效應(yīng)，為實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性保駕護(hù)航。

2、嵌合體篩選

F0 代小鼠有很大概率是嵌合體，即其身體部分細(xì)胞攜帶突變基因。為獲得穩(wěn)定遺傳的純合子，需要將 F0 代小鼠與野生型小鼠進(jìn)行配種，繁育出 F1 代，再?gòu)?F1 代中篩選出純合子個(gè)體。

表型分析與品系建立

1、表型分析

生理功能檢測(cè)：密切觀察子代小鼠在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的各項(xiàng)生理指標(biāo)，包括生長(zhǎng)速度、行為模式、代謝水平等方面是否出現(xiàn)異常，以此推斷基因敲除對(duì)小鼠整體生理功能的影響。

分子水平驗(yàn)證：運(yùn)用 Western blot、qPCR 等分子生物學(xué)技術(shù)，檢測(cè)目標(biāo)蛋白或者 mRNA 在小鼠體內(nèi)的表達(dá)情況，確定是否因基因敲除而出現(xiàn)表達(dá)缺失，從分子層面揭示基因功能變化。

組織學(xué)分析：制作小鼠組織病理切片，在顯微鏡下細(xì)致觀察不同組織器官的結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形態(tài)變化，探尋是否存在組織特異性的表型改變，進(jìn)一步剖析基因敲除引發(fā)的深層次生物學(xué)效應(yīng)。

2、品系純化

通過(guò)連續(xù)回交或者兄妹交配的方式，在 F1 代、F2 代中逐步篩選并培育出純合子個(gè)體，建立起穩(wěn)定遺傳的基因敲除小鼠品系，為后續(xù)深入研究提供可靠的動(dòng)物模型。

注意事項(xiàng)

脫靶效應(yīng)：在實(shí)驗(yàn)前期，要充分利用生物信息學(xué)工具預(yù)測(cè)可能出現(xiàn)的脫靶位點(diǎn)，對(duì)于關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)，如有必要還需進(jìn)行全基因組測(cè)序驗(yàn)證，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的精準(zhǔn)性，避免因脫靶效應(yīng)導(dǎo)致錯(cuò)誤結(jié)論。

胚胎存活率：由于顯微注射操作具有一定的侵入性，很可能對(duì)胚胎造成損傷，進(jìn)而影響其存活率。所以在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，要反復(fù)優(yōu)化注射條件，包括注射物質(zhì)的濃度、注射體積等參數(shù)，盡可能降低對(duì)胚胎的傷害，保障實(shí)驗(yàn)順利推進(jìn)。

基因型 - 表型關(guān)聯(lián)：鑒于 F0 代嵌合體小鼠表型可能不明顯，不能僅憑 F0 代表型判斷基因功能，需要通過(guò)繁育獲得 F1 代，對(duì) F1 代進(jìn)行全面系統(tǒng)的表型分析，以此建立準(zhǔn)確的基因型 - 表型關(guān)聯(lián)，揭示基因的真實(shí)功能。