3月17日，上�？萍即髮W(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院王皞鵬課題組聯(lián)合中國科學(xué)院分子細胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心許琛琦課題組、美國匹茲堡大學(xué)醫(yī)學(xué)院Dario Vignali課題組、北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院孔燕課題組及百濟神州沈志榮團隊，在國際頂尖學(xué)術(shù)期刊Cell雜志在線發(fā)表了題為“Ligand-Induced Ubiquitination Unleashes LAG3 Immune Checkpoint Function by Hindering Membrane Sequestration of Signaling Motifs”的最新研究論文。該研究首次解析了免疫檢查點LAG3受體激活的分子開關(guān)機制，并開發(fā)了基于功能性生物標志物的療效預(yù)測體系，為靶向免疫檢查點的精準治療提供了新策略。

南模生物為該研究提供了LAG3-KO（目錄號：NM-KO-18048）和LAG3^K490R小鼠。

LAG3作為一種免疫檢查點受體，在調(diào)節(jié)T細胞活化和抗腫瘤免疫方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。據(jù)報道，多個配體與LAG3相互作用，包括MHC II類和FGL1，前者在抗原呈遞細胞上表達，后者分別由肝細胞和某些類型的腫瘤細胞分泌。當(dāng)與配體結(jié)合時，LAG3會抑制T細胞活化、細胞因子生成和增殖，從而促進腫瘤免疫逃逸。

1 在T細胞激活過程中，MHC II類介導(dǎo)的配體結(jié)合會引發(fā)LAG3快速泛素化
作者利用T細胞-APC共培養(yǎng)系統(tǒng)，將人LAG3異位表達于Jurkat T細胞，與表達MHC II的Raji B細胞共培養(yǎng)并激活TCR。質(zhì)譜分析結(jié)果顯示，激活的T細胞中 LAG3的498位點賴氨酸發(fā)生泛素化，而靜止T細胞中未檢測到。進一步研究表明，與MHC II結(jié)合缺陷的突變體LAG3^P115A不能發(fā)生泛素化，阻斷LAG3與MHC II結(jié)合的relatlimab也能完全抑制LAG3泛素化，以上結(jié)果證明LAG3泛素化依賴于配體結(jié)合。此外，作者利用LAG3^K490R小鼠（由南模生物提供）（LAG3的490位賴氨酸突變?yōu)榫�氨酸，相�?dāng)于人類的K498位點）證實了在小鼠CD4和CD8初級T細胞中，抗原刺激同樣會使LAG3 大量泛素化，且 K490是關(guān)鍵的泛素化位點。

以上結(jié)果表明，在T細胞活化過程中，MHC II類結(jié)合會觸發(fā)位于LAG3胞質(zhì)尾中部的保守賴氨酸殘基快速泛素化。

Fig1. 配體結(jié)合誘導(dǎo)LAG3的快速泛素化。

Fig2. 膜結(jié)合型而非可溶性FGL1觸發(fā)LAG3的泛素化。

3 LAG3泛素化不會導(dǎo)致蛋白質(zhì)降解，反而會增強LAG3的功能
為探究泛素化修飾對LAG3蛋白穩(wěn)定性的影響，作者比較了野生型（LAG3^WT）與泛素化位點突變型（LAG3^KR）小鼠T細胞在活化過程中LAG3的表達動態(tài)。結(jié)果表明，LAG3^WT與LAG3^KR的LAG3蛋白表達水平無顯著差異。進一步采用蛋白質(zhì)合成抑制劑放線菌酮（CHX）阻斷新蛋白合成后，無論處于靜息狀態(tài)或活化狀態(tài)，LAG3^WT與LAG3^KR蛋白的半衰期均相似。以上結(jié)果表明，LAG3的泛素化修飾并不參與其蛋白降解調(diào)控。

鑒于不同類型多聚泛素化介導(dǎo)的生物學(xué)功能具有差異，作者首先確定了LAG3特異性泛素化鏈類型。質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)主要存在K48、K63及非經(jīng)典K11連接型泛素鏈。進一步分析發(fā)現(xiàn)LAG3活化后主要發(fā)生非K48連接型、非降解性多聚泛素化（與蛋白酶體降解相關(guān)的泛素化為K48）。

同時，作者發(fā)現(xiàn)Relatlimab（阻斷LAG3介導(dǎo)的T細胞活化負調(diào)控）可完全抑制LAG3泛素化，提示泛素化可能調(diào)控其抑制功能，且在Jurkat T細胞-Raji細胞共培養(yǎng)體系中，Relatlimab可逆轉(zhuǎn)LAG3對IL-2分泌的抑制作用。此外，LAG3^KR突變體（無法發(fā)生泛素化）幾乎失去抑制活性。綜上，泛素化通過非降解途徑正向調(diào)控LAG3的免疫抑制功能。
 

Fig3.  泛素化以不依賴于蛋白質(zhì)降解的方式調(diào)控LAG3功能。

4 Cbl家族E3泛素連接酶介導(dǎo)LAG3的泛素化
為了探究參與LAG3泛素化的E3連接酶，研究人員采用TurboID標記技術(shù)，發(fā)現(xiàn)c-Cbl和Cbl-b可能是介導(dǎo)LAG3泛素化的關(guān)鍵E3連接酶。作者進一步構(gòu)建了c-CbI和CbI-b單敲除及雙敲除的Jurkat T細胞模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，單獨敲除c-Cbl或Cbl-b均無法阻斷LAG3泛素化，LAG3功能仍保留；而雙敲除細胞中LAG3泛素化完全消失，喪失抑制活性；進一步在雙敲除Jurkat細胞中回補c-Cbl或Cbl-b，可顯著恢復(fù)LAG3泛素化及其功能。這些結(jié)果表明，Cbl家族連接酶通過介導(dǎo)LAG3泛素化正向調(diào)控其免疫抑制功能。
 

Fig4. Cbl-b和c-Cbl介導(dǎo)LAG3的泛素化及其抑制功能。

5 LAG3 泛素化通過阻礙膜結(jié)合釋放抑制信號
為進一步明確泛素化調(diào)控LAG3功能的分子機制。作者首先對LAG3進行了序列分析，結(jié)果顯示，LAG3的近膜段存在一個進化保守的堿性殘基富集序列（BRS）基序。作者推測LAG3的BRS基序可能通過膜結(jié)合限制FSALE基序的可及性。為驗證這一推測，作者使用多種生物物理測定方法，證實了LAG3-NCR和LAG3-FL能與模擬細胞膜的PMLC結(jié)合，且 FSALE 基序插入到膜雙層的疏水內(nèi)部。而LAG3泛素化可有效破壞這種相互作用，使FSALE基序暴露，從而激活LAG3信號傳導(dǎo)。
 

Fig5. LAG3信號尾部嵌入細胞膜，經(jīng)Ub修飾后釋放。

6 LAG3 泛素化通過阻礙膜結(jié)合釋放抑制信號
為探究LAG3泛素化在體內(nèi)抗腫瘤免疫中的作用，作者通過檢測 LAG3^KR小鼠（LAG3泛素化缺陷）的T細胞功能，發(fā)現(xiàn)其在體外對T細胞激活和功能的抑制作用受損，產(chǎn)生的細胞因子增多，T細胞增殖抑制能力下降。體內(nèi)實驗中，作者在LAG3^WT、LAG3^KR及LAG3^KO小鼠皮下接種MC38結(jié)腸癌，聯(lián)合PD-1阻斷治療。結(jié)果顯示，相較于LAG3^WT小鼠，LAG3^KR小鼠腫瘤進展顯著減緩，生存率顯著提高，產(chǎn)生干擾素γ（IFN-γ）的T細胞比例顯著增多，這一結(jié)果與LAG3^KO相似。以上結(jié)果表明，LAG3泛素化在體內(nèi)對LAG3介導(dǎo)的抗腫瘤免疫抑制起著關(guān)鍵作用。
 

Fig6. LAG3泛素化在LAG3介導(dǎo)的抗腫瘤免疫抑制中的關(guān)鍵作用。

Fig7. LAG3泛素化作為癌癥免疫治療中的潛在生物標志物。

總的來說，這項研究揭示了LAG3與配體結(jié)合后的蛋白質(zhì)翻譯后修飾（PTM），發(fā)現(xiàn)配體誘導(dǎo)的泛素化不僅可作為 LAG3信號傳導(dǎo)的指標，還充當(dāng)LAG3功能的分子開關(guān)。在沒有配體的情況下，LAG3主要通過暴露的EP基序發(fā)揮其抑制作用，而FSALE基序則與細胞膜結(jié)合而被隔離。在與配體結(jié)合后，LAG3在E3泛素化連接酶Cbl介導(dǎo)的 KIEELE 基序內(nèi)迅速發(fā)生泛素化，使FSALE從細胞膜上釋放，從而實現(xiàn)LAG3的功能。

這項研究揭示了一種具有轉(zhuǎn)化潛力的癌癥免疫治療中的免疫檢查點觸發(fā)機制，并開發(fā)了可預(yù)測LAG3治療效果的新型生物標志物，為腫瘤免疫的精準治療提供了新策略。

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