腦出血（intracerebral hemorrhage, ICH）是指非外傷性腦內(nèi)血管破裂導(dǎo)致的血液異常聚集，是腦卒中（Stroke）的一種重要亞型。早期研究認為，中樞神經(jīng)系統(tǒng)作為“免疫特權(quán)”器官，因此往往忽略了在ICH后的免疫炎癥過程中外周免疫細胞的來源及作用。但是隨著對大腦免疫特征的進一步了解，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)存在外周免疫應(yīng)答影響ICH后的免疫活動。

胃腸道是免疫細胞的主要儲存場所，在全身免疫反應(yīng)中起著至關(guān)重要的作用，尤其是在疾病狀態(tài)下。目前已有研究表明腸道菌群失調(diào)會影響腦卒中后相關(guān)免疫炎癥反應(yīng)。然而腸道和大腦之間的通信網(wǎng)絡(luò)錯綜復(fù)雜，迷走神經(jīng)在其調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用。但迷走神經(jīng)是否也控制免疫細胞從腸道到大腦的運動，這可能導(dǎo)致神經(jīng)炎癥。需要更多的研究來探索這種可能性，尤其是在中風(fēng)病例中。

河南省人民醫(yī)院張杰文、蔣超教授聯(lián)合鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院王建教授、王君敏副教授團隊成員在生物醫(yī)學(xué)1區(qū)雜志《Theranostics》（最新 IF: 12.4）上發(fā)表論文，報道了迷走神經(jīng)-乙酰膽堿軸可通過促進腸道免疫細胞表面α4β7與αEβ7整合素的表達抑制腸道免疫細胞的遷移并改善腦出血預(yù)后。這一發(fā)現(xiàn)為腦出血的免疫調(diào)節(jié)治療提供了新的策略和思路。
 

研究材料與方法：
在這項研究中，為了明確存在腸道免疫細胞在腦出血后浸潤至出血腦部，研究人員采用 Kikume Green-Red (KikGR)基因型小鼠（由賽業(yè)生物提供）分別采用小鼠大體及組織活體成像，全景熒光掃描，流式細胞學(xué)技術(shù)等方法多角度明確了該遷移現(xiàn)象。KikGR是一種基因敲入型小鼠，其全身廣泛表達Kikume-Green熒光蛋白，初始表現(xiàn)為綠色自發(fā)熒光。在經(jīng)過近紫外光（350-420nm）照射后，熒光會從綠色轉(zhuǎn)變?yōu)榧t色（Kikume-Red）。

技術(shù)路線：
通過對 KikGR基因型小鼠腸系膜淋巴結(jié)進行光轉(zhuǎn)換處理，明確腦出血后存在腸道免疫細胞向出血腦部遷移；

通過對KikGR和野生型 (WT) 小鼠行迷走神經(jīng)離斷術(shù)并設(shè)置對照組，驗證迷走神經(jīng)在腦出血后對腸道免疫細胞遷移的影響；

明確迷走神經(jīng)-乙酰膽堿軸對腦出血后對腸道免疫細胞遷移的影響；

明確迷走神經(jīng)-乙酰膽堿軸對腸道免疫細胞表面β7相關(guān)整合素表達的影響，并拮抗β7整合素觀察腦出血后近期神經(jīng)功能損傷及遠期神經(jīng)功能恢復(fù)情況。

研究結(jié)果：
研究人員通過對KikGR小鼠腸系膜淋巴結(jié)進行光轉(zhuǎn)換處理并在迷走神經(jīng)離斷后建立腦出血模型，通過使用小動物活體成像技術(shù)動態(tài)觀察了小鼠頭部及軀干部位紅色熒光表達強度，然后采用全場景熒光掃描以及流式細胞分析等進一步驗證了上述發(fā)現(xiàn)。結(jié)果表明，腸道免疫細胞可于腦出血急性期廣泛遷移至血腫周圍、腦膜與頸深淋巴結(jié)等部位，且迷走神經(jīng)的存在會抑制這一現(xiàn)象。

迷走神經(jīng)離斷可顯著增加浸潤至出血腦部α4β7和CD103陽性免疫細胞的比例，然而使用乙酰膽堿受體激動劑卻可逆轉(zhuǎn)這一現(xiàn)象。并且通過使用β7整合素受體拮抗劑，可以增加出血腦部免疫細胞比例，且該過程不受乙酰膽堿受體激動劑調(diào)控。上述發(fā)現(xiàn)證實迷走神經(jīng)-乙酰膽堿軸可通過促進腸道免疫細胞表面α4β7與αEβ7整合素的表達抑制腸道免疫細胞的遷移并改善腦出血預(yù)后。
 

研究表明，α4β7與αEβ7整合素可促進免疫細胞向腸道歸巢并促使其滯留于腸道。使用β7整合素功能拮抗性抗體（Etrolizumab）可以影響腦出血后急性期神經(jīng)損傷程度及遠期神經(jīng)功能恢復(fù)。在使用Etrolizumab后加重了3天時腦損傷程度參考標準為3天腦損傷體積，腦腫脹程度及腦含水量；同時加重了28天時殘余病灶體積；在行為學(xué)評分中，應(yīng)用Etrolizumab亦出現(xiàn)評分降低的結(jié)果。

上述發(fā)現(xiàn)證實迷走神經(jīng)-乙酰膽堿軸可通過促進腸道免疫細胞表面α4β7與αEβ7整合素的表達抑制腸道免疫細胞的遷移并改善腦出血預(yù)后。

研究結(jié)論：
在此項研究中，研究人員采用多種技術(shù)反復(fù)驗證了腸道免疫細胞可于腦出血后遷移至出血腦部并影響腦出血預(yù)后，且腦出血后腸道免疫細胞的遷移受迷走神經(jīng)-乙酰膽堿軸調(diào)控的α4β7與αEβ7整合素表達的影響。該研究立足于腦出血后中樞-外周免疫系統(tǒng)的交互作用及調(diào)控機制，深入探索了迷走神經(jīng)通過調(diào)控腸道免疫細胞的遷移影響出血腦部免疫炎性反應(yīng)及預(yù)后的機制。該研究為未來腦出血免疫調(diào)節(jié)治療的轉(zhuǎn)化研究提供了新的思路。

應(yīng)用體會：
研究團隊通過動物活體成像技術(shù)、流式細胞學(xué)技術(shù)、全場景熒光掃描技術(shù)靈活運用KikGR工具鼠，進而驗證了ICH后存在腸道免疫細胞向出血腦部遷移這一現(xiàn)象。在使用過程中，研究人員遞進性摸索使用該款基因鼠，發(fā)現(xiàn)由于熒光穿透性有限，該小鼠須在褪毛后使用方可完成數(shù)據(jù)采集，且針對器官組織的熒光強度應(yīng)使用活體取材的方法獲取，這也限制了動態(tài)采集組織內(nèi)病理變化的能力。第二在流式細胞學(xué)技術(shù)中由于該熒光屬于自發(fā)性熒光因此在使用時應(yīng)避免使用與接收光波長重合的抗體，使得流式抗體的選擇有一定的局限性，可檢測相關(guān)指標過少。第三該小鼠優(yōu)勢在于可直接切片獲取熒光信息，但是在此過程中應(yīng)注意切片厚度，盡量使用低于10um的組織切片，避免出現(xiàn)陽性細胞重合導(dǎo)致數(shù)據(jù)采集混亂。整體來講該小鼠可在多種熒光采集系統(tǒng)中應(yīng)用，大大增加了研究機體內(nèi)細胞動態(tài)遷移的方法和技術(shù)，是一種有效的基因型工具鼠。