男性不育是全球范圍內(nèi)日益受到重視的醫(yī)學(xué)與社會問題。據(jù)統(tǒng)計，約15%的育齡夫婦面臨生育困難，其中約50%與男性因素直接相關(guān)。男性不育的主要原因包括精子數(shù)量減少、活力下降、形態(tài)異常，以及精子功能缺陷等。盡管輔助生殖技術(shù)（如體外受精和卵胞漿內(nèi)單精子注射）在一定程度上幫助了部分患者，但針對精子異常導(dǎo)致的胚胎發(fā)育問題，尤其是精子因素引發(fā)的早期胚胎停滯，仍缺乏明確的病因機(jī)制和有效治療策略。

近日，上海交通大學(xué)附屬第九人民醫(yī)院輔助生殖科蘆雪峰團(tuán)隊首次報告了TDRD6基因突變是導(dǎo)致男性少弱畸形精子癥（OAT）及早期胚胎停滯的致病原因，深入探索了Tdrd6基因變異導(dǎo)致男性不育的機(jī)制，全面闡明了精子相關(guān)卵母細(xì)胞激活缺陷（OAD）影響2PN階段的基因表達(dá)，并揭示了輔助卵子激活（AOA）技術(shù)克服由男性因素引起的胚胎停滯的機(jī)制。這篇題為“Altered zygotic gene expression caused by sperm with Tdrd6 variants disrupts early embryonic development”的研究成果于2025年1月6日發(fā)表在《MedComm》雜志上。

圖片來源：《MedComm》
(https://doi.org/10.1002/mco2.70038)

研究材料與方法
在此項研究中，研究團(tuán)隊通過二代測序技術(shù)對兩名男性不育患者進(jìn)行了精準(zhǔn)的分子診斷，發(fā)現(xiàn)他們是TDRD6基因變異患者。隨后通過構(gòu)建Tdrd6基因敲入和敲除小鼠模型（由賽業(yè)生物提供），深入探索了Tdrd6基因變異導(dǎo)致男性不育的機(jī)制，利用適當(dāng)劑量的AOA技術(shù)成功克服了由于Tdrd6基因變異引發(fā)的早期胚胎發(fā)育停滯問題，在小鼠模型中促成了成功妊娠和活產(chǎn)，且子代無明顯異常。在解析機(jī)制時，研究團(tuán)隊采用了ICSI、AOA、MOAT、RNA-seq等方法。

技術(shù)路線
01 利用二代測序技術(shù)進(jìn)行了精準(zhǔn)的分子診斷，發(fā)現(xiàn)TDRD6基因變異男性不育患者
02 通過構(gòu)建Tdrd6基因敲入和敲除小鼠模型，探索了該基因變異致男性不育的機(jī)制
03 利用AOA技術(shù)成功克服了由Tdrd6基因變異引發(fā)的早期胚胎發(fā)育停滯問題

研究結(jié)果
1. TDRD6基因突變是導(dǎo)致OAT及早期胚胎停滯的致病原因
根據(jù)全外顯子組測序（WES）分析，研究人員在2個OAT和ICSI治療早期胚胎停育的獨(dú)立家系中的2個不育男性個體中發(fā)現(xiàn)了TDRD6突變。家系1（Ⅱ-1）的患病個體攜帶純合移碼突變c.3026 - 3027delinsC（p.N1010Ifs*3），導(dǎo)致蛋白提前終止。家系2（Ⅱ- 1）中患病個體攜帶復(fù)合雜合變異c.A1256G（p.Y419C）和c.15501553delinsT（p.519del）。所有變異均經(jīng)Sanger測序驗證（圖1）。
 

 
圖1：TDRD6基因突變是導(dǎo)致OAT及早期胚胎停滯的致病原因

為了進(jìn)一步研究Tdrd6基因變異導(dǎo)致男性不育的機(jī)制，研究團(tuán)隊利用了賽業(yè)生物提供的由CRISPR系統(tǒng)構(gòu)建的Tdrd6基因敲入和敲除小鼠模型（圖2）。

圖2：TDRD6基因敲除小鼠的策略

睪丸和附睪的組織學(xué)分析顯示，小鼠模型的附睪中幾乎沒有精子，并且缺乏長形精子細(xì)胞，提示精子發(fā)生障礙。精子H&E染色和TEM分析發(fā)現(xiàn)小鼠模型的精子頭部形狀不規(guī)則，細(xì)胞核形態(tài)異常，細(xì)胞質(zhì)殘留過多，頂體脫落，核周膜結(jié)構(gòu)疏松(圖3)。
 

 
圖3：Tdrd6^{N1015Tfs*3/N1015Tfs*3} 和Tdrd6^−/−雄性小鼠精子頭部畸形和PLC-ζ分布異常

2. TDRD6突變導(dǎo)致PLC-ζ分布異常和卵母細(xì)胞激活缺陷
為了研究TDRD6變異患者精子的卵母細(xì)胞激活能力，研究人員進(jìn)行了小鼠卵母細(xì)胞激活試驗（MOAT），結(jié)果顯示，2例TDRD6變異患者的2PN和2-細(xì)胞胚胎比例均顯著低于健康供者，反映了TDRD6變異患者精子的卵母細(xì)胞激活能力缺陷。注射TDRD6變異患者的精子后用2.5μM離子霉素激活小鼠卵母細(xì)胞，顯著提高了2PN率和2細(xì)胞率。

PLC-ζ是一種位于核周膜的關(guān)鍵精子傳播卵母細(xì)胞活化因子，可誘導(dǎo)Ca²⁺振蕩并啟動卵母細(xì)胞活。研究人員檢測了TDRD6突變患者精子中PLC-ζ 定位、PLC-ζ 表達(dá)和Ca²⁺ 振蕩模式。免疫熒光實(shí)驗顯示PLC-ζ位于正常獲能精子的頂體區(qū)域和頸部，TDRD6突變患者精子中的PLC-ζ 信號分布異常，僅定位于頸部，而不是頂體區(qū)域；免疫印跡實(shí)驗證實(shí)，TDRD6突變患者精子中的PLC-ζ 表達(dá)低于正常供體；鈣震蕩監(jiān)測發(fā)現(xiàn)將正常供體的精子注射到小鼠卵母細(xì)胞后，30分鐘內(nèi)出現(xiàn)了2次Ca²⁺峰值；使用TDRD6突變患者的精子時無峰值；在注射TDRD6突變患者的精子后，用2.5μM離子霉素激活小鼠卵母細(xì)胞導(dǎo)致Ca²⁺激增成功。這些發(fā)現(xiàn)表明TDRD6變異患者的精子在 PLC-ζ分布和表達(dá)方面存在缺陷，導(dǎo)致無法誘發(fā)Ca²⁺振蕩，從而導(dǎo)致卵母細(xì)胞活化失�。▓D4）。
 

圖4：TDRD6變異導(dǎo)致PLC-ζ分布異常且無法觸發(fā)Ca²⁺振蕩，ICSI-AOA提高了TDRD6變異患者精子的卵母細(xì)胞活化能力

3. 用適當(dāng)?shù)腁OA可挽救ICSI中的Tdrd6 / TDRD6缺陷
在小鼠和人類中使用適當(dāng)?shù)腁OA挽救ICSI中的Tdrd6/TDRD6缺陷作為一種化學(xué)卵母細(xì)胞激活劑，離子霉素被廣泛用于克服受精失敗，但其在克服早期胚胎停滯方面的有效性尚不清楚。因此，我們對Tdrd6^{N1015Tfs*3/N1015Tfs*3}和Tdrd6^-/-小鼠進(jìn)行了不同工作濃度的離子霉素（1.0、2.5和10.0μM）的ICSI-AOA，以研究它是否可以改善受精和胚胎發(fā)育。令人驚訝的是，與非AOA 處理相比，用1.0、2.5和10.0μM離子霉素處理顯著提高了Tdrd6^{N1015Tfs*3/N1015Tfs*3}和Tdrd6^-/-小鼠精子的受精率。然而，只有含有2.5μM 離子霉素的 ICSI-AOA 成功克服了小鼠精子的早期胚胎停滯，并顯著提高了囊胚率。

為了進(jìn)一步研究Tdrd6^{N1015Tfs*3/N1015Tfs*3}和Tdrd6^-/-小鼠是否能通過含有2.5μM 離子霉素的ICSI-AOA產(chǎn)生自己的后代，將雙細(xì)胞胚胎移植到假妊娠小鼠體內(nèi)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)胚胎成功植入并發(fā)育成正常的幼崽（圖5）。

圖5：2.5μM離子霉素克服了Tdrd6^{N1015Tfs*3/N1015Tfs*3}和Tdrd6^-/-小鼠的男性不育癥

4. Mos在受精卵中的異常表達(dá)會導(dǎo)致早期胚胎停滯
為了探究使用離子霉素進(jìn)行AOA克服Tdrd6 ^{- / -}小鼠早期胚胎停育的機(jī)制，研究人員對WT組、Tdrd6 ^{- / -}組和Tdrd6 ^{- / -} ICSI - AOA組（2.5 μM離子霉素激活)的受精卵進(jìn)行了RNA測序，通過對RNA測序數(shù)據(jù)的KEGG和GO分析，研究人員從中找到了鈣信號通路相關(guān)的Camkk2基因和胚胎發(fā)育相關(guān)的Mos基因（圖6）。

圖6：Camkk2或Mos的低水平表達(dá)可能是Tdrd6^-/-小鼠早期胚胎停滯的潛在機(jī)制

為了確認(rèn)胚胎中Mos和Camkk2的表達(dá)水平，研究人員在用不同濃度離子霉素處理的WT受精卵和Tdrd6^−/−受精卵的不同胚胎發(fā)育階段進(jìn)行了qRT-PCR，結(jié)果顯示，在 Tdrd6^−/−小鼠的PN4階段，Mos和Camkk2的表達(dá)水平確實(shí)很低，并且用2.5μM AOA處理挽救了Tdrd6^−/− PN4期胚胎中Mos和Camkk2的表達(dá)。因此，研究人員認(rèn)為Camkk2或Mos的低水平表達(dá)可能是 Tdrd6^-/-小鼠早期胚胎停滯的潛在機(jī)制（圖7）。

隨后，研究人員通過Mos或Camkk2 mRNA顯微注射Tdrd6 ^{- / -} 小鼠PN4受精卵，并觀察隨后的胚胎發(fā)育，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，用Camkk2 mRNA顯微注射的受精卵表現(xiàn)出更高的四細(xì)胞胚胎百分比，但胚胎沒有發(fā)育成囊胚。相比之下，Mos mRNA的顯微注射成功克服了早期胚胎停滯并顯著增加了囊胚率（圖6），表明Mos在Tdrd6 ^{- / -} 合子發(fā)育中起重要作用。
 

圖7：Tdrd6 ^{- / -} 精子受精引起Mos在受精卵中異常表達(dá)，從而導(dǎo)致早期胚胎停滯

研究結(jié)論
此研究通過構(gòu)建Tdrd6基因敲入和敲除小鼠模型，探索了Tdrd6基因變異導(dǎo)致男性不育的機(jī)制，全面闡明了精子相關(guān)OAD影響2PN階段的基因表達(dá)，并揭示了AOA克服由男性因素引起的胚胎停滯的機(jī)制。