往期我們已經(jīng)為大家詳細介紹了利用CRISPR/Cas9構(gòu)建編輯小鼠和細胞系的全部過程，相信大家在了解從sgRNA設(shè)計、表達載體構(gòu)建至顯微注射、小鼠鑒定等一系列過程的同時，常會為這樣的難題所困擾：歷經(jīng)3-6個月得到的基因敲除的小鼠/細胞，PCR鑒定的結(jié)果居然和WB蛋白結(jié)果不一致？竟開始懷疑自己這幾個月是不是白做了？灰心的絕望著：自己是不是不適合搞科研！小編溫馨提示：不要驚慌，打開本文你就知道，究竟你編輯的小鼠/細胞是不是正確的？

基因編輯小鼠/細胞的鑒定方法之PCR

目前PCR方法因具有快速、靈敏、費用低等特點，被廣泛應(yīng)用于對基因編輯小鼠基因型鑒定的實驗中。一般而言，針對不同基因修飾類型的小鼠，需要設(shè)計不同的引物來進行鑒定。

• 實驗原理：首先，設(shè)計能與引入的外源基因結(jié)合的特異性引物，擴增原本不存在于動物基因組中的DNA序列；對于基因敲除小鼠和細胞，則在基因修飾的位置針對靶點上下游約200~300bp區(qū)域分別設(shè)計正反向PCR引物。突變型和野生型PCR產(chǎn)物的大小應(yīng)不同，大小區(qū)別在100bp以上的，可以直接用凝膠電泳區(qū)別鑒定；若無法用凝膠電泳直接鑒定的基因型，可以將PCR產(chǎn)物進一步測序驗證。

• 實驗過程：提取基因修飾動物的DNA、用PCR反應(yīng)擴增靶序列、瓊脂糖凝膠電泳、檢測DNA片段的有無和大小，進一步測序以確定基因型。具體操作步驟如下圖1，我們也在往期有詳細介紹（鏈接：基因編輯小鼠——基因型鑒定，2016-11-2）   

圖1.  小鼠基因型鑒定步驟

問題來了，WB鑒定蛋白與PCR測序結(jié)果不一致怎么辦？

如當(dāng)我們委托第三方構(gòu)建小鼠或細胞時，第三方公司提供的鑒定報告一般只包括上述提到的基因組DNA水平的PCR和測序結(jié)果，即保證在DNA 水平的敲除，并以此給出模型已經(jīng)構(gòu)建成功的結(jié)論！但是我們往往需要去驗證蛋白的功能，因為蛋白才是生物學(xué)功能的最終執(zhí)行者。這樣就導(dǎo)致了一種現(xiàn)象，默認蛋白Western blot（WB）檢測結(jié)果本該像中心法則那樣，與基因組水平的DNA測序結(jié)果相對應(yīng)，然而卻發(fā)現(xiàn)蛋白的WB結(jié)果與DNA的PCR和測序結(jié)果不一致，我們開始慌了，這究竟怎么回事，這個模型沒有構(gòu)建成功？如果遇到這種問題，我們該如何處理呢？

首先，我們需明確: WB鑒定的結(jié)果不一定可靠！

1.  WB只是建立在DNA序列正確基礎(chǔ)上檢測蛋白表達的一種手段，其結(jié)果不能單方面作為鑒定結(jié)果的判斷。

運用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建編輯的基因敲除小鼠或者細胞是在基因組水平對靶向基因進行了目標(biāo)DNA序列的敲除（圖2）�；�因（Gene）是核酸分子中儲存信息的遺傳單位，是指儲存有功能的蛋白多肽鏈或RNA序列信息及表達這些信息所必需的全部核苷酸序列，因此蛋白的合成是在基因的指導(dǎo)下完成的。也就是說基因是蛋白表達的基礎(chǔ)，沒有DNA序列的改變就不會有蛋白表達的改變，所以鑒定DNA序列的改變是最為基礎(chǔ)的。

圖2.  CRISPR/Cas9 介導(dǎo)DNA敲除原理圖[1]

2.   有WB條帶不一定就代表蛋白還有功能！

基因敲除一般分為兩種情況：一種是把目的基因的DNA外顯子編碼序列全部敲除；第二種是敲除外顯子上部分編碼蛋白的序列，因為敲除的外顯子序列為非三的整數(shù)倍，所以這種情況會造成蛋白翻譯移碼突變，從而進一步實現(xiàn)了相應(yīng)蛋白功能的敲除。因此如果通過對目標(biāo)序列進行PCR和測序鑒定確定目的基因在DNA水平刪除了相應(yīng)DNA 序列的話，相應(yīng)的蛋白就會因為缺少正確的DNA翻譯模板無法合成正確的蛋白。而WB抗體本身存在一定的非特異性結(jié)合，有可能出現(xiàn)假陽性結(jié)果。所以，有WB條帶不一定就代表蛋白還有功能。

舉個例子：

有研究者曾經(jīng)發(fā)表文章（WeiqunYu et al. 2013）來檢驗P2Y₆蛋白商品化抗體的特異性和有效性，作者依據(jù)兩個標(biāo)準(zhǔn)篩選了3家公司的商品化抗體：

1）候選的抗體曾經(jīng)有研究者驗證過抗體的特異性并曾在公開刊物上發(fā)表；

2）候選的抗體針對P2Y6蛋白不同部位的抗原表位。

曾經(jīng)使用候選抗體并公開發(fā)表的文獻的實驗數(shù)據(jù)和各抗體廠家的使用說明書上的資料都顯示，所選的抗體在特異性和有效性上都具有很大的潛力。但是實驗結(jié)果卻表明WT小鼠和P2Y6基因敲除小鼠抗體檢測結(jié)果并無明顯差異（圖3），雖然其中兩種抗體在該研究者的實驗之前都有不少于一篇的文獻證明其他研究者使用該抗體得到了非常好的特異性和漂亮的圖片結(jié)果。那造成這種不一致現(xiàn)象的原因可能是在不含有P2Y6的組織中，仍然存在著能被該抗體識別的其他抗原。

圖3.  三種不同 P2Y6 抗體特異性檢測[2]

所以，WB的結(jié)果有時并不那么可信，因此不推薦采用WB來驗證！那除了PCR測序和WB驗證，還有其他什么方法呢？

基因表達分為轉(zhuǎn)錄及翻譯兩階段，轉(zhuǎn)錄是以DNA（基因）為模板生成mRNA的過程，翻譯是以mRNA為模板生成蛋白的過程（圖4），檢測基因的表達就是檢測特異mRNA及特異蛋白的生成。所以基因表達檢測分為兩個水平：即轉(zhuǎn)錄水平上對特異mRNA的檢測和翻譯水平上對特異蛋白的檢測。

圖4.  基因表達翻譯原理圖[3]

1.   轉(zhuǎn)錄水平上對特異mRNA的檢測：

主要方法有Northern雜交，它是以DNA或RNA為探針，檢測RNA鏈，也可用RT-PCR （reverse transcribed PCR）方法檢測DNA的轉(zhuǎn)錄表達。其原理是以小鼠或細胞總RNA或mRNA為模板進行反轉(zhuǎn)錄，然后再經(jīng)PCR擴增或熒光定量PCR；如果從小鼠組織或細胞總RNA提取物中沒有得到特異的cDNA擴增條帶，則能從轉(zhuǎn)錄水平驗證了基因敲除。

2.   翻譯水平上對蛋白功能的檢測：

主要是對蛋白生物學(xué)活性的檢測，如果我們敲除的基因具有生化反應(yīng)活性或其他的生物學(xué)活性，那么我們還可以通過相應(yīng)的酶反應(yīng)或者生物學(xué)活性來進行蛋白水平的驗證。

綜上所述，基因型的鑒定應(yīng)以PCR測序為準(zhǔn)，在蛋白水平的WB驗證并不是判斷的唯一標(biāo)準(zhǔn)，我們可以從該基因的生物活性或者RNA轉(zhuǎn)錄水平入手，多角度驗證小鼠或細胞系的基因敲除。

參考文獻：

[1] Maeder,M.L. & Gersbach, C.A. Genome-editing Technologies for Gene and CellTherapy.Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy(2016).

[2] Weiqun Yu&Warren G. Hill. Lack of specificity shown by P2Y6 receptor antibodies.Naunyn-Schmiedeberg's Arch Pharmacol(2013) 386:885–891.

[3] http://203.92.44.117/mirtronPred/