急性心肌梗死(acute myocardial infarction, AMI)是一種全球范圍內(nèi)高發(fā)病率和高死亡率的心血管疾病，嚴重威脅人類生命健康。雖然我國AMI防治工作已取得了初步成效，但仍面臨嚴峻挑戰(zhàn)，其發(fā)病率和死亡率仍呈上升態(tài)勢。及時有效地再灌注治療是挽救急性心肌梗死的有效手段，然而心臟血流恢復(fù)往往會進一步加重心肌損傷，這個過程稱為心肌缺血再灌注 (ischmia reperfusiom, I/R) 損傷。心肌缺血再灌注損傷機制復(fù)雜，臨床上仍然缺乏針對性的防治策略，因此，尋找調(diào)控I/R損傷的新分子機制和防治策略具有重要意義。

2024年4月2日，哈爾濱醫(yī)科大學楊寶峰院士、杜偉杰教授團隊在氧化還原領(lǐng)域雜志《Redox Biology》(IF:11.4)發(fā)表題為“The positive feedback loop of the NAT10/Mybbp1a/p53 axis promotes cardiomyocyte ferroptosis to exacerbate cardiac I/R injury”的研究論文。該研究通過篩選心肌缺血再灌注心臟組織基因表達數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)NAT10可能為調(diào)控心肌缺血再灌注損傷的候選基因。通過在體構(gòu)建心肌細胞特異性NAT10基因敲除小鼠和過表達NAT10小鼠，離體構(gòu)建原代乳鼠心肌細胞過表達和小干擾RNA干擾NAT10表達，明確NAT10缺失會改善I/R誘導(dǎo)的小鼠心臟功能損傷和心肌細胞鐵死亡，并且明確了NAT10調(diào)控I/R損傷的分子機制，為缺血性心臟病防治提供新策略。中國工程院院士、哈爾濱醫(yī)科大學楊寶峰教授和哈爾濱醫(yī)科大學杜偉杰教授為本文的共同通訊作者，哈爾濱醫(yī)科大學博士研究生曲哲哲、碩士龐小琛為本文共同第一作者。
 

研究材料
在本項研究中，作者采用Loxp-cre系統(tǒng)構(gòu)建心肌細胞特異性NAT10條件敲除小鼠模型（由賽業(yè)公司提供）。腺相關(guān)病毒構(gòu)建的基因過表達和敲減小鼠模型

研究方法
在本研究中采取了轉(zhuǎn)錄組，修飾組測序檢測NAT10下游靶點；CHIP, ac-RIP, co-IP等IP實驗驗證DNA-蛋白，RNA-蛋白, 蛋白-蛋白相互結(jié)合；PCR和western blot檢測RNA和蛋白表達水平；酶學試劑盒檢測小鼠心臟損傷水平；超聲心動圖分析小鼠心臟功能；透射電鏡檢測線粒體形態(tài)等。

技術(shù)路線

1. 檢測到I/R小鼠心臟NAT10表達上調(diào)，為尋找其上調(diào)原因，運用Jaspar網(wǎng)站預(yù)測到NAT10潛在轉(zhuǎn)錄因子P53。通過干擾P53，明確P53為I/R損傷中調(diào)控NAT10上調(diào)的啟動子
2. 構(gòu)建NAT10心肌細胞特異性條件敲除小鼠，尾靜脈注射NAT10腺相關(guān)病毒,檢測NAT10對I/R小鼠心臟功能的影響。發(fā)現(xiàn)NAT10調(diào)控I/R誘導(dǎo)的心肌細胞鐵死亡的發(fā)生。
3. 通過對I/R和對照小鼠的轉(zhuǎn)錄組和修飾組測序結(jié)果的調(diào)和分析，發(fā)現(xiàn)Mybbp1a的mRNA發(fā)生了 NAT10催化的ac4C乙�；�修飾。
4. Mybbp1a mRNA的乙�；�修飾導(dǎo)致其穩(wěn)定性增加，其蛋白表達水平增加，促進P53與其蛋白乙�；�酶P300的結(jié)合，從而促進P53的乙�；�激活。
5. P53作為鐵死亡抑制因子SLC7A11的轉(zhuǎn)錄抑制因子，抑制其轉(zhuǎn)錄的發(fā)生從而誘導(dǎo)I/R期間心肌細胞鐵死亡。
6. 通過干預(yù)Mybbp1a可以挽救過表達NAT10導(dǎo)致的小鼠心臟功能下降，心肌細胞鐵死亡表型。

研究結(jié)果

 
圖1 P53是調(diào)控NAT10表達上調(diào)的轉(zhuǎn)錄激活因子

首先，作者檢測了小鼠I/R損傷心臟組織中NAT10 mRNA和蛋白表達水平，發(fā)現(xiàn)NAT10在I/R組織中表達上調(diào)。隨后，通過Jaspar網(wǎng)站作者預(yù)測到P53可能是NAT10的潛在轉(zhuǎn)錄因子。通過構(gòu)建NAT10啟動子的雙熒光素酶質(zhì)粒，檢測得到P53與NAT10啟動子結(jié)合；CHIP實驗進一步驗證P53與NAT10啟動子相互結(jié)合。在心肌細胞中敲減P53和過表達P53，發(fā)現(xiàn)敲減P53下調(diào)H/R誘導(dǎo)的NAT10的表達增加；過表達P53上調(diào)NAT10的表達水平。在體給予P53腺相關(guān)病毒并構(gòu)建I/R模型，結(jié)果表明P53缺失下調(diào)I/R組織中NAT10的表達。

圖2 NAT10誘導(dǎo)心肌細胞鐵死亡表型

為了進一步探究NAT10在心肌細胞鐵死亡中的作用，研究人員構(gòu)建了心肌細胞缺氧12小時，復(fù)氧24小時模型，離體水平檢測到過表達NAT10在生理和病理條件下都促進心肌細胞鐵死亡；而敲減NAT10則起相反作用。

圖3 敲除NAT10可以預(yù)防I/R誘導(dǎo)的心肌細胞鐵死亡

為了進一步探究NAT10是否是心臟I/R損傷誘導(dǎo)的鐵死亡的關(guān)鍵，作者構(gòu)建了心肌細胞特異性敲除小鼠模型（NAT10^CKO，由賽業(yè)生物提供）。誘導(dǎo)敲除后，小鼠I/R心臟的心臟功能如射血分數(shù)，短軸縮短分數(shù)得到改善，心臟梗死面積降低，鐵死亡相關(guān)Marker如GPX4的表達上調(diào)，線粒體形態(tài)恢復(fù)，脂質(zhì)過氧化物產(chǎn)生減少。

圖4 NAT10誘導(dǎo)心肌鐵死亡加重心臟I/R損傷

作者進一步構(gòu)建了AAV9-NAT10心肌細胞特異性過表達腺相關(guān)病毒，并對感染腺相關(guān)病毒的小鼠構(gòu)建I/R模型，結(jié)果表明，過表達NAT10誘導(dǎo)心肌細胞鐵死亡表型。此外，作者對構(gòu)建I/R模型并過表達NAT10 的小鼠心臟使用細胞死亡相關(guān)抑制劑，結(jié)果表明，與凋亡相比，鐵死亡在I/R和NAT10 誘導(dǎo)的細胞死亡中占主導(dǎo)。

圖5 Mybbp1a是介導(dǎo)NAT10調(diào)控I/R誘導(dǎo)鐵死亡的靶標

作者在對轉(zhuǎn)錄組和修飾組學測序數(shù)據(jù)的聯(lián)合分析及KEGG和GO富集分析中，探索了NAT10的ac4C修飾靶點，發(fā)現(xiàn)Mybbp1a的mRNA被ac4C修飾且促進其穩(wěn)定性增加。我們進一步構(gòu)建了Mybbp1a的腺相關(guān)病毒，并檢測了Mybbp1a的上生物學功能，發(fā)現(xiàn)Mybbp1a敲除可以改善I/R誘導(dǎo)的小鼠心肌細胞鐵死亡。

圖6 Mybbp1a逆轉(zhuǎn)NAT10誘導(dǎo)心肌細胞鐵死亡

作者接下來運用NAT10過表達腺相關(guān)病毒和Mybbp1a敲減腺相關(guān)病毒同時感染了小鼠心臟，并構(gòu)建心臟I/R損傷模型，結(jié)果表明Mybbp1a能夠抑制NAT10誘導(dǎo)的心肌鐵死亡表型。據(jù)據(jù)報道，Mybbp1a通過增強p53乙�；�和在細胞應(yīng)激時通過募集P300介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活誘導(dǎo)細胞死亡，作者進一步檢測了NAT10對P53和P300的結(jié)合水平，發(fā)現(xiàn)NAT10可以促進P300和P53的相互結(jié)合。此外，NAT10敲除也可以降低心臟I/R損傷導(dǎo)致的P53和P300的結(jié)合增加。以上結(jié)果表明，P53是NAT10調(diào)控心臟I/R損傷的最終效應(yīng)因子，因此，作者進一步驗證了p53對鐵死亡的調(diào)控作用。已有研究表明，乙�；�的p53通過抑制SLC7A11的轉(zhuǎn)錄表達，抑制胱氨酸的攝取，并使細胞對鐵死亡敏感。因此作者實施了CHIP實驗驗證了在H/R誘導(dǎo)的心肌細胞中，過表達NAT10促進P53與SLC7A11啟動子的結(jié)合，而siMybbp1a則使二者結(jié)合下降。
 

圖7 Remodelin可以減輕I/R心臟損傷

上述結(jié)果表明NAT10是治療I/R的潛在靶點。為了進一步驗證這一假設(shè)，作者用一種NAT10的小分子抑制劑remodelin預(yù)處理小鼠，研究其是否能改善心臟I/R損傷�？诜�Remodelin顯著降低I/ r誘導(dǎo)的小鼠心臟梗死面積的增加及心臟功能的損傷。對I/R誘導(dǎo)的心肌細胞鐵死亡也具有改善作用。

綜合上述結(jié)果表明，通過藥理和基因干預(yù)NAT10可以挽救I/R損傷導(dǎo)致的心肌細胞鐵死亡，建立了一種可能得治療策略。

研究結(jié)論
綜上所述，本研究揭示了NAT10是心臟I/R后心肌細胞鐵死亡的重要調(diào)節(jié)因子。證明NAT10通過介導(dǎo)ac4C修飾增加Mybbp1a的穩(wěn)定性，通過誘導(dǎo)P300介導(dǎo)的P53乙酰化和激活導(dǎo)致SLC7A11的轉(zhuǎn)錄抑制。同時，p53通過轉(zhuǎn)錄上調(diào)NAT10的表達，從而與NAT10/Mybbp1a/SLC7A11形成正反饋回路，加重心臟I/R損傷。這些發(fā)現(xiàn)提示，靶向p53/NAT10/Mybbp1a軸是治療心臟I/R損傷的新方向。