條件性基因敲除小鼠模型在揭示乳酸如何影響免疫治療效果中的應用

瀏覽次數(shù)：955　發(fā)布日期：2024-11-4　來源：本站　僅供參考，謝絕轉(zhuǎn)載，否則責任自負

近年來，免疫檢查點阻斷療法（ICB）在對抗癌癥方面取得了很大進展。CTLA-4單抗是首個獲批上市的免疫檢查點抑制劑。作為一種抑制性檢查點，CTLA-4在活化T細胞和腫瘤浸潤調(diào)節(jié)性T（Treg）細胞上高表達。CTLA-4單抗不僅能夠增強效應T細胞的功能，還能清除腫瘤內(nèi)Treg細胞。然而，部分患者無法響應CTLA-4單抗治療，而且治療還會產(chǎn)生嚴重的免疫治療相關(guān)不良反應。

腫瘤細胞為了維持生存會進行大量的有氧糖酵解，導致乳酸在腫瘤微環(huán)境中過度積累。目前已知Treg細胞利用乳酸來維持其免疫抑制功能�？紤]到CTLA-4在Treg細胞中的重要性，乳酸是否調(diào)節(jié)Treg細胞中CTLA-4的表達，進而影響對CTLA-4阻斷療法的應答，這個問題值得深入探究。

近日，上海交通大學基礎醫(yī)學院鄒強研究員領導的研究團隊發(fā)現(xiàn)，乳酸通過RNA剪接機制促進腫瘤浸潤Treg細胞中CTLA-4的表達，有助于提高CTLA-4阻斷療法的效果。這項研究成果發(fā)表在《Immunity》雜志上，確定了Treg細胞中乳酸與RNA剪接之間的機制關(guān)聯(lián)，對自身免疫和抗腫瘤免疫具有治療方面的意義。

上海交大團隊揭示乳酸如何影響免疫治療的效果
圖片來源：《Immunity》
（https://doi.org/10.1016/j.immuni.2024.01.019）

研究材料與方法
在這項研究中，研究人員構(gòu)建了多種條件性基因敲除小鼠模型（其中Slc16a1-floxed小鼠由賽業(yè)生物提供），以研究MCT1、USP39和CTLA-4蛋白的功能和關(guān)聯(lián)。他們利用Treg細胞的單細胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析了乳酸攝取對轉(zhuǎn)錄程序的影響。在分析蛋白質(zhì)相互作用時，他們采用了RNA免疫沉淀（RIP）以及CUT&RUN方法。在體外實驗中，他們還從小鼠的脾臟和淋巴結(jié)中純化出初始CD4+ T細胞，并誘導其分化為Treg細胞。

技術(shù)路線
01 敲除小鼠Treg細胞中的乳酸轉(zhuǎn)運蛋白，以分析乳酸攝取對CTLA-4阻斷療法的影響
02 敲除小鼠Treg細胞和腫瘤浸潤Treg細胞中的USP39，以分析USP39的功能作用
03 探索乳酸攝取對Treg細胞轉(zhuǎn)錄程序的影響，分析USP39缺失是否改變RNA剪接
04 確定乳酸影響RNA剪接和CTLA-4表達的分子機制

研究結(jié)果
1. Treg細胞攝取乳酸有助于提高CTLA-4阻斷的效果
乳酸是由Treg細胞中的單羧酸轉(zhuǎn)運蛋白1（MCT1）轉(zhuǎn)運的。為了探討Treg細胞對乳酸的利用是否會影響CTLA-4阻斷療法，研究人員將Slc16a1-floxed小鼠（由賽業(yè)生物提供，MCT1由Slc16a1基因編碼）與Foxp3-Cre-YFP小鼠雜交，構(gòu)建了條件性基因敲除小鼠（Slc16a1fl/flFoxp3-Cre），其Treg細胞中的Slc16a1被特異性敲除。

他們發(fā)現(xiàn)，CTLA-4抗體治療能有效阻止瘤內(nèi)Treg細胞的聚集，并激發(fā)強烈的抗腫瘤T細胞反應。不過，Slc16a1fl/flFoxp3-Cre荷瘤小鼠對CTLA-4抗體治療未產(chǎn)生應答，它們在接受或未接受抗體治療的情況下，腫瘤生長和抗腫瘤免疫并無明顯差異，表明Treg細胞攝取乳酸有助于提高CTLA-4阻斷的效果（圖1）。

圖1 Treg細胞攝取乳酸有助于提高CTLA-4阻斷的效果[1]

2. RNA剪接機制與腫瘤浸潤Treg細胞特征有關(guān)
為了探索乳酸攝取對Treg細胞內(nèi)在的轉(zhuǎn)錄程序有何影響，研究人員分析了結(jié)直腸癌中Treg細胞的單細胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。他們發(fā)現(xiàn)，Treg細胞來源的RNA剪接過程與SLC16A1 mRNA的表達相關(guān)，且腫瘤浸潤Treg細胞的RNA剪接相關(guān)通路特征打分高于外周Treg細胞。此外，SLC16A1的表達與泛素特異性蛋白酶39（USP39）的表達呈正相關(guān)，而USP39是RNA剪接機制的組分之一。這些結(jié)果表明，Treg細胞中的RNA剪接與腫瘤微環(huán)境中Treg細胞特征有關(guān)。

3. USP39通過CTLA-4維持Treg細胞的功能
接下來，研究人員構(gòu)建了條件性基因敲除小鼠（Usp39fl/flFoxp3-Cre），其Treg細胞中的Usp39被特異性敲除。他們發(fā)現(xiàn)，這些小鼠出現(xiàn)致命的自身免疫表型，其嚴重程度與Foxp3缺陷型小鼠和CTLA-4缺陷型小鼠類似，表明Treg細胞介導的免疫抑制存在嚴重缺陷。此外，USP39缺陷型Treg細胞無法表達Treg細胞的特征基因，包括Foxp3、Ctla4、Pdcd1和Il10。這些結(jié)果表明，USP39缺失會破壞Treg細胞身份，導致致命的自身免疫。

他們之后特異性敲除了腫瘤浸潤Treg細胞中的USP39，發(fā)現(xiàn)USP39的破壞明顯抑制了腫瘤進展并提高了小鼠的存活率。在USP39缺陷型Foxp3+ Treg細胞中，CTLA-4的表達較低。他們還進一步敲除了小鼠Treg細胞中的CTLA-4和USP39，發(fā)現(xiàn)能夠有效抑制腫瘤生長并促進抗腫瘤T細胞反應。不過在Ctla4fl/flFoxp3CreERT2荷瘤小鼠中，USP39缺失卻不會改變腫瘤生長或抗腫瘤T細胞反應，表明USP39通過CTLA-4維持Treg細胞的免疫抑制功能。

4. USP39促進Ctla4 RNA的高效剪接
那么，USP39缺失是否會改變Treg細胞的RNA剪接模式？轉(zhuǎn)錄組分析的結(jié)果表明，USP39缺失會導致1235個剪接事件發(fā)生改變，且USP39缺失導致50個和30個剪接位點的效率降低（圖2），表明USP39對Treg細胞中的RNA剪接至關(guān)重要。USP39的缺失也導致Ctla4表達下降。RNA免疫沉淀分析表明，USP39與Ctla4 pre-mRNA結(jié)合（圖2）。此外，USP39缺失會降低腫瘤浸潤Treg細胞中Ctla4成熟mRNA與pre-mRNA的比例。這些數(shù)據(jù)表明，USP39是Ctla4 RNA高效剪接所必需的。

圖2 USP39調(diào)節(jié)Treg細胞的RNA剪接程序[1]

之后，研究人員利用體外系統(tǒng)探索了USP39對Treg細胞功能基因的RNA剪接有何作用。與對照相比，USP39缺失會降低Ctla4成熟mRNA與pre-mRNA的比例，但不會改變其他Treg細胞功能基因的RNA剪接效果，這表明USP39的缺失會選擇性影響Treg細胞中Ctla4 RNA的剪接。雌性Usp39fl/flFoxp3-Cre/+小鼠的分析也證實了這一點，由于X染色體的隨機失活，大約一半的Treg細胞缺乏USP39。這些結(jié)果表明，USP39介導的RNA剪接是Treg細胞中CTLA-4表達所必需的。

5. 乳酸調(diào)節(jié)USP39介導的CTLA-4表達
最后，研究人員探究了Treg細胞中乳酸與USP39之間的潛在聯(lián)系。他們在Usp39的啟動子區(qū)域發(fā)現(xiàn)了Foxp3的結(jié)合位點。在乳酸處理后，F(xiàn)oxp3+ Treg細胞中USP39和CTLA-4表達水平增加，表明乳酸誘導Foxp3表達，然后促進Treg細胞中USP39依賴性的CTLA-4表達。在阻斷乳酸攝取后，Usp39表達和Ctla4 RNA剪接效率降低，但USP39缺陷型Treg細胞中Ctla4 RNA剪接的效率沒有改變。這些結(jié)果表明，在腫瘤浸潤Treg細胞中，乳酸調(diào)節(jié)了USP39介導的CTLA-4表達。

研究結(jié)論

圖3 Treg細胞中乳酸與RNA剪接之間的機制[1]

這項研究表明，乳酸通過調(diào)節(jié)RNA剪接來增加CTLA-4的表達并增強Treg細胞的免疫抑制功能，這有助于提高CTLA-4阻斷療法的效果。這些發(fā)現(xiàn)確定了一種環(huán)境機制，它能夠維持Treg細胞內(nèi)RNA剪接機制的活性，進而支持Treg細胞的功能狀態(tài)和CTLA-4阻斷的應答。研究還表明，抑制USP39可能會降低Treg細胞的抗腫瘤免疫屏障，對腫瘤治療產(chǎn)生影響。

參考文獻：
[1]Ding et al., Lactate modulates RNA splicing to promote CTLA-4 expression in tumor-infiltrating regulatory T cells, Immunity (2024), https://doi.org/10.1016/j.immuni.2024.01.019

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