7月18日，賽業(yè)生物細胞基因編輯項目管理常天一主講「基因編輯細胞技術及其研究應用」線上課程，以下為本次直播常見問題匯總與解答。

FAQ:
1.細胞編輯移碼敲除和片段敲除該如何選擇？
2.如何提高點突變項目的成功率？
3.基因敲入細胞系構建原理？
4.iPSC重編程都會做哪些檢測？
5.敲除細胞系出現(xiàn)WB檢測蛋白殘留該如何解決？
6.基因敲除細胞系構建的實驗難點和注意事項？
 

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Q：細胞編輯移碼敲除和片段敲除該如何選擇？
A ：移碼敲除是指使用一條sgRNA在蛋白編碼基因的外顯子內(nèi)產(chǎn)生雙鏈斷裂，若NHEJ修復導致了缺口處產(chǎn)生了非3倍數(shù)的刪除或者插入，則會造成蛋白翻譯時的讀碼框移碼（Framshift），從而產(chǎn)生一個截短的、功能失活的蛋白質(zhì)。

片段敲除是指在目的敲除位置兩側各設計一條gRNA，兩條gRNA同時作用形成兩個DSB，NHEJ修復造成目的DNA片段的缺失，從而導致該片段中包含的基因失去功能。

兩種方案都是可行的敲除方案，我們會根據(jù)目的基因信息，是否有文獻報道等情況，綜合考量使用哪種方案。

Q：如何提高點突變項目的成功率？
A：點突變的項目的成功率和cell pool階段的同源重組效率密切相關。賽業(yè)生物優(yōu)化的α-donor體系將人源化的Cas蛋白、gRNA和donor三組分轉(zhuǎn)染至目的細胞，HDR效率高達87%，實現(xiàn)單克隆純合子交付，快至6周。

Q：基因敲入細胞系構建原理？
A：sgRNA和Cas蛋白使目的位置發(fā)生雙鏈斷裂，同時引入了一個donor，donor中包含要插入的DNA序列、和目標基因組位置同源的DNA序列（同源臂），利用同源重組修復（HDR）機制來修復雙鏈斷裂，將外源DNA序列插入到目標位置。

Q：iPSC重編程都會做哪些檢測？
A：iPSC重編程檢測內(nèi)容包括無菌支原體檢測、質(zhì)粒殘留分析、STR鑒定、核型分析、免疫熒光、流式檢測、體外三胚層檢測，畸胎瘤實驗。

Q：敲除細胞系出現(xiàn)WB檢測蛋白殘留該如何解決？

A：出現(xiàn)WB檢測蛋白殘留可能的原因：
Western Blot抗體的選擇不合適；
基因的可變剪切引起的蛋白殘留；
由于目的基因的多轉(zhuǎn)錄本引起的蛋白殘留；
目的蛋白本底表達低；
遺傳補償效應：無義突變和同源序列。

可參考Western blot trouble shooting思路圖進行原因排查。

1.細胞和基因信息分析
確保細胞和基因的準確性；
核對敲除策略和gRNA設計位置，確保gRNA設計在保守區(qū)域且盡可能覆蓋所有轉(zhuǎn)錄本；
分析目的基因是否有同源基因，如有同源基因可能會存在遺傳補償效應；
分析目的基因在宿主細胞內(nèi)的本底表達水平，相應調(diào)整Western blot參數(shù)。

2.DNA水平分析
檢查鑒定策略是否合適，PCR電泳條帶與預期是否一致；
核查測序原始數(shù)據(jù)，測序質(zhì)量是否合格，分析測序結果檢查是否還有未敲除干凈的序列，與野生型序列進行比對確保敲除成功。

3.mRNA水平分析
兩種方法可以在mRNA水平進行驗證：
方法1：使用賽業(yè)生物RDDC罕見病數(shù)據(jù)中心對突變進行可變剪切預測，如產(chǎn)生移碼和提前終止，則認為mRNA水平敲除合格。
方法2：提取細胞mRNA進行cDNA PCR和測序，并與野生型進行比對，確定mRNA水平是否敲除成功。

4.蛋白水平分析
根據(jù)DNA測序結果，使用相應軟件將KO后的DNA翻譯成氨基酸序列，并與野生型氨基酸序列進行比對，確定氨基酸水平是否發(fā)生敲除。

5.抗體分析
KO驗證和文獻驗證更優(yōu)，比對抗體免疫原位點與敲除區(qū)域位點，免疫原位點C端優(yōu)于N端，核對抗體是單克隆或者多克隆，單克隆優(yōu)于多克��；抗體的品牌，進口優(yōu)于國產(chǎn)。

Q: 基因敲除細胞系構建的實驗難點和注意事項？

A：1.分子設計方面的難點：
敲除策略選擇不當；
基因拷貝數(shù)多，gRNA切割不徹底；
gRNA設計位置不當，如未能覆蓋重要轉(zhuǎn)錄本；
gRNA設計不當，如效率低，脫靶率高等。

解決方法：在分子設計方面結合賽業(yè)生物Smart CRISPR基因編輯系統(tǒng)和經(jīng)驗豐富的生信分子團隊進行相應的基因分析和設計，確保敲除成功。

2.細胞方面的難點：
遞送方式、培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染和單克隆制備困難。

解決方法：遞送方式建議選擇RNP，效率高且低脫靶，摸索細胞培養(yǎng)條件，優(yōu)化轉(zhuǎn)染方法和單克隆，確保敲除實驗前獲取最優(yōu)條件。