胰腺癌是一種預(yù)后極差的惡性腫瘤，對(duì)全球健康造成重大挑戰(zhàn)。這種癌癥的發(fā)病率逐年上升，但目前的治療選擇很有限。腫瘤微環(huán)境（TME）在胰腺癌的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用，其特點(diǎn)是廣泛纖維化，且存在癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAF）。CAF調(diào)節(jié)胰腺癌的發(fā)病過程，包括腫瘤生長、免疫逃逸和耐藥性等。因此，靶向調(diào)節(jié)CAF是提高胰腺癌療效的一種潛在策略。

細(xì)胞外囊泡（EV）經(jīng)過改造，可將治療劑（如遺傳物質(zhì)或藥物）輸送到目標(biāo)位點(diǎn)，故引起了科學(xué)界的廣泛興趣。來源于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞外囊泡（BMSC-EV）既具有EV的優(yōu)勢(shì)，又具有BMSC的相關(guān)特性，安全性高，在腫瘤發(fā)展過程中可被招募到TME并分化成CAF。因此，BMSC-EV是一種大有前景的胰腺癌治療方法，有望破壞CAF和癌細(xì)胞之間的對(duì)話，逆轉(zhuǎn)纖維化的TME，并改善治療效果。

近日，南京醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院張業(yè)偉教授領(lǐng)導(dǎo)的研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，工程化細(xì)胞外囊泡可以實(shí)現(xiàn)對(duì)CAF的靶向重編程，進(jìn)而調(diào)控胰腺癌的腫瘤微環(huán)境。這項(xiàng)研究成果于2024年6月24日發(fā)表在《Signal Transduction and Targeted Therapy》雜志（IF = 40.8）上，有望提高現(xiàn)有化療方案的療效，改善胰腺癌患者的預(yù)后。
 

圖片來源：《Signal Transduction and Targeted Therapy》
（https://doi.org/10.1038/s41392-024-01872-7）

研究材料與方法
在這項(xiàng)研究中，研究人員構(gòu)建了以胰腺CAF為靶點(diǎn)的工程化細(xì)胞外囊泡（IEVs-PFD/138）。他們利用雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)和免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)分析了miR-138-5p的作用機(jī)制。他們接著通過2D的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)以及3D的多細(xì)胞腫瘤球狀體實(shí)驗(yàn)和皮下異種移植模型，研究了IEVs-PFD/138對(duì)胰腺CAF靶向重編程的影響。最后，他們還利用C-NKG小鼠（由賽業(yè)生物提供，產(chǎn)品編號(hào)：C001316）構(gòu)建了患者來源的異種移植（PDX）模型，并和胰腺癌原位小鼠模型研究了IEVs-PFD/138和吉西他濱的聯(lián)合治療效果。

技術(shù)路線
01 構(gòu)建以胰腺CAF為靶點(diǎn)的工程化細(xì)胞外囊泡IEVs-PFD/138并表征其特征
02 確定miR-138-5p的目標(biāo)基因，分析其在CAF中的作用機(jī)制
03 通過體外和體內(nèi)分析研究IEVs-PFD/138對(duì)腫瘤生長和藥物遞送的影響
04 利用PDX模型和胰腺癌原位模型研究IEVs-PFD/138和吉西他濱的聯(lián)合治療效果

研究結(jié)果
1. IEVs-PFD/138的制備和表征
研究人員利用miRNA芯片比較了胰腺CAF和健康成纖維細(xì)胞（NF）之間的差異表達(dá)miRNA，發(fā)現(xiàn)miR-138-5p在兩者之間差異較大。與NF相比，CAF中的miR-138-5p表達(dá)下調(diào)。在建立永生化的CAF細(xì)胞系后，他們發(fā)現(xiàn)miR-138-5p模擬物可降低CAF的增殖率和遷移率。由此可見，miR-138-5p可對(duì)CAF的表型進(jìn)行重編程，且在胰腺CAF中的表達(dá)下調(diào)。

接下來，研究人員構(gòu)建了以胰腺CAF為靶點(diǎn)的工程化細(xì)胞外囊泡。他們?cè)趤碓从贐MSC的EV中加入miR-138-5p模擬物和抗纖維化藥物吡非尼酮（PFD），并用整合素α5靶向肽對(duì)其進(jìn)行表面修飾，構(gòu)建出IEVs-PFD/138（圖1）。Western blot、透射電鏡和納米顆粒追蹤分析證實(shí)了IEVs-PFD/138的各種特性。
 

圖1 IEVs-PFD/138的制備和表征^[1]

之后他們檢驗(yàn)了工程化IEVs的CAF靶向能力。與非靶向EVs相比，CAF對(duì)IEVs的吸收率更高。同樣地，與IEVs-138共同孵育的CAF中的熒光信號(hào)高于與EVs-138共同孵育的CAF，證實(shí)整合素α5靶向肽提高了CAF靶向能力。在皮下纖維化胰腺癌模型中，IEVs的靶向能力高于未修飾的EVs。IEVs發(fā)出的熒光信號(hào)明顯更高，表明IEVs到達(dá)胰腺癌部位的能力增強(qiáng)。

2. miR-138-5p在CAF中的功能機(jī)制
為了闡明miR-138-5p在CAF中的作用機(jī)制，研究人員在挖掘數(shù)據(jù)庫后鎖定了與CAF相關(guān)性最強(qiáng)的FERMT2。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，miR-138-5p與FERMT2存在直接的相互作用。他們發(fā)現(xiàn)，FERMT2的表達(dá)與CAF的增殖和遷移呈正相關(guān)。在胰腺癌細(xì)胞群中，F(xiàn)ERMT2表達(dá)量最高的是CAF，其次是癌細(xì)胞，表明該基因在腫瘤-基質(zhì)相互作用和TME中發(fā)揮潛在作用。此外，F(xiàn)ERMT2的病理評(píng)分與胰腺癌患者的臨床分期呈正相關(guān)。

免疫共沉淀分析表明，FERMT2與TGFBR1發(fā)生相互作用。miR-138-5p直接抑制了FERMT2-TGFBR1復(fù)合物的形成，從而抑制了TGF-β信號(hào)通路的激活。此外，F(xiàn)ERMT2還與膠原蛋白形成通路呈正相關(guān)，而PYCR1這種酶參與了脯氨酸代謝，調(diào)節(jié)膠原蛋白的沉積。分析發(fā)現(xiàn)miR-138-5p通過直接靶向FERMT2-PYCR1復(fù)合物，抑制了脯氨酸介導(dǎo)的膠原蛋白合成。

3. IEVs-PFD/138處理抑制了CAF的促腫瘤作用
體外分析表明，IEVs-PFD/138抑制了FERMT2-TGFBR1和FERMT2-PYCR1復(fù)合物的形成，并抑制了CAF中促炎因子和促腫瘤發(fā)生因子的產(chǎn)生。通過調(diào)節(jié)CAF中的脯氨酸代謝，IEVs-PFD/138還降低了細(xì)胞內(nèi)的脯氨酸含量。此外，將EV處理后的CAF的條件培養(yǎng)基與胰腺癌細(xì)胞PANC-1共同培養(yǎng)后，研究人員發(fā)現(xiàn)IEVs-PFD/138能夠高效抑制PANC-1細(xì)胞增殖、遷移和侵襲（圖2）。

胰腺癌的TME中存在致密的細(xì)胞外基質(zhì)，讓抗癌療法很難滲透。為了應(yīng)對(duì)這一挑戰(zhàn)，他們將PANC-1細(xì)胞與CAF共同培養(yǎng)，建立了富含基質(zhì)的3D多細(xì)胞腫瘤球狀體模型。在IEVs-PFD/138處理后，熒光探針滲透性增加，3D腫瘤球狀體明顯縮小，并在球狀體周圍觀察到壞死細(xì)胞（圖2）。這些結(jié)果表明，IEVs-PFD/138可通過抑制纖維化基質(zhì)的形成和改善藥物遞送，增強(qiáng)小分子抗腫瘤藥物在胰腺癌TME中的療效。

為了研究IEVs-PFD/138在體內(nèi)的治療意義和機(jī)制，研究人員通過聯(lián)合移植PANC-1細(xì)胞和CAF，建立了小鼠皮下胰腺癌模型，并在小鼠靜脈中注射EVs，進(jìn)行7個(gè)周期的治療。結(jié)果表明，IEVs-PFD/138表現(xiàn)出明顯的抗腫瘤效果，顯著延長了裸鼠的存活時(shí)間。后續(xù)分析發(fā)現(xiàn)，IEVs-PFD/138處理能夠抑制腫瘤細(xì)胞增殖和TGF-β信號(hào)通路，逆轉(zhuǎn)CAF的激活，減少膠原蛋白的沉積，并且不會(huì)對(duì)重要器官產(chǎn)生毒性作用，表明這是一種很有前景的胰腺癌治療策略。
 

圖2 IEVs-PFD/138可逆轉(zhuǎn)CAF表型、抑制癌細(xì)胞并增強(qiáng)藥物滲透^[1]
 

4. IEVs-PFD/138和GEM在多個(gè)癌癥模型中的聯(lián)合治療效果
之后，研究人員又利用C-NKG小鼠（由賽業(yè)生物提供）構(gòu)建了患者來源異種移植（PDX）模型，并研究了IEVs-PFD/138和吉西他濱（GEM，一種化療藥物）的聯(lián)合治療效果（圖3）。IEVs-PFD/138和GEM聯(lián)合治療組的腫瘤生長速度最慢，且腫瘤重量最輕。此外，IEVs-PFD/138能夠有效減少腫瘤基質(zhì)的生成，促進(jìn)GEM向腫瘤細(xì)胞的遞送，表明它有可能協(xié)同增強(qiáng)了GEM在PDX模型中的治療效果。通過抑制TGF-β通路，IEVs-PFD/138還逆轉(zhuǎn)了CAF的激活。另外，IEVs-PFD/138處理后，缺氧誘導(dǎo)因子HIF1A表達(dá)下調(diào)，而核苷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ENT1表達(dá)增加，促進(jìn)了細(xì)胞內(nèi)GEM的積累，并改善了治療反應(yīng)（圖3）。
 

圖3 IEVs-PFD/138在患者來源異種移植胰腺癌模型中的治療效果^[1]

研究人員最后還建立了胰腺癌原位小鼠模型，以便全面反映腫瘤生物學(xué)和治療反應(yīng)。他們?cè)谛∈箪o脈中依次注射IEVs-PFD/138和GEM，進(jìn)行7個(gè)周期的治療。他們發(fā)現(xiàn)，GEM和IEVs-PFD/138的聯(lián)合使用可顯著抑制腫瘤生長。與對(duì)照組相比，聯(lián)合治療組的腫瘤體積最小，且小鼠均未發(fā)生腹膜轉(zhuǎn)移。此外，IEVs-PFD/138促使CAF失活并抑制膠原蛋白分泌，降低了膠原蛋白含量。GEM能降低胰腺癌細(xì)胞的遷移能力，而IEVs-PFD/138的加入進(jìn)一步增強(qiáng)了這種效果，與觀察到的腹膜轉(zhuǎn)移減少一致。

研究結(jié)論
這項(xiàng)研究展示了一種利用工程化EVs（IEVs-PFD/138）治療胰腺癌的新方法。除了增強(qiáng)治療藥物的滲透性外，這種方法還直接抑制了CAF的腫瘤促進(jìn)作用。IEVs-PFD/138與標(biāo)準(zhǔn)化療藥物GEM的聯(lián)合治療效果令人鼓舞，在小鼠模型中顯示出抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的協(xié)同效應(yīng)。這種基于工程化EVs的策略為胰腺癌的治療提供了新思路，有望改善胰腺癌患者的預(yù)后和生活質(zhì)量。

參考文獻(xiàn)：
[1]Zhou, P., Du, X., Jia, W. et al. Engineered extracellular vesicles for targeted reprogramming of cancer-associated fibroblasts to potentiate therapy of pancreatic cancer. Sig Transduct Target Ther 9, 151 (2024). https://doi.org/10.1038/s41392-024-01872-7