造血干細(xì)胞（hematopoietic stem cell, HSCs）是一類(lèi)具有自我更新能力，并且能夠分化成各個(gè)血液譜系的干細(xì)胞，是構(gòu)成整個(gè)血液系統(tǒng)的基礎(chǔ)。其增殖分化缺陷會(huì)導(dǎo)致一系列血液疾病的發(fā)生，如白血病，紅斑狼瘡以及貧血等。目前，治療惡性血液疾病（白血�。┑闹饕�治療手段是進(jìn)行骨髓移植，而獲取足夠數(shù)量的造血干細(xì)胞是移植成功的關(guān)鍵。因此，我們有必要深入探究調(diào)控HSCs擴(kuò)增的分子網(wǎng)絡(luò)。

2024年3月15日，西南大學(xué)、中國(guó)科學(xué)院重慶綠色智能技術(shù)研究院李禮課題組和羅凌飛課題組在 Nature communications 上發(fā)表了題為“TANGO6 regulates cell proliferation via COPI vesicle-mediated RPB2 nuclear entry”的論文。該研究綜合利用細(xì)胞系以及小鼠等動(dòng)物模型，揭示TANGO6通過(guò)COPI囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)控RPB2入核進(jìn)而驅(qū)動(dòng)細(xì)胞增殖這一新機(jī)制來(lái)促進(jìn)造血干/祖細(xì)胞的擴(kuò)增。
 

圖片來(lái)源：《Nature communications》
（https://www.nature.com/articles/s41467-024-46720-y）

研究材料與方法
在這項(xiàng)研究中，研究人員利用到了TANGO6敲除細(xì)胞系（U251）以及條件性敲除/過(guò)表達(dá)Tango6小鼠（由賽業(yè)生物提供）。

研究方法
在這項(xiàng)研究中，觀察TANGO6的亞細(xì)胞定位時(shí)他們用到了細(xì)胞周期同步化，免疫熒光染色等技術(shù)。在探究與TANGO6相互作用的蛋白時(shí)，他們用到了質(zhì)譜，免疫共沉淀等實(shí)驗(yàn)。在觀察條敲小鼠表型時(shí)，他們用到了流式細(xì)胞術(shù)等技術(shù)。

技術(shù)路線(xiàn)
01 通過(guò)siRNA文庫(kù)篩選挖掘到TANGO6
02 細(xì)胞周期同步化明確不同細(xì)胞周期的定位
03 TANGO6拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)鑒定及結(jié)構(gòu)域解析
04 質(zhì)譜挖掘與TANGO6互作蛋白-RPB2
05 敲降TANGO6后發(fā)現(xiàn)RPB2累積在細(xì)胞漿中
06 利用小鼠證實(shí)TANGO6-RPB2信號(hào)軸的保守性

研究結(jié)果
1 通過(guò)siRNA文庫(kù)篩選發(fā)現(xiàn)TANGO6及其亞細(xì)胞定位
通過(guò)膜轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的siRNA文庫(kù)篩選，研究人員發(fā)現(xiàn)了一個(gè)全新的因子TANGO6，其缺陷會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞增殖受阻。并且通過(guò)細(xì)胞周期同步化發(fā)現(xiàn)TANGO6在G1/S期開(kāi)始入核，而在G2期恢復(fù)。進(jìn)一步的亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn)TANGO6定位在順面高爾基體衍生出的COPI囊泡上，其缺陷并不影響COPI囊泡的各個(gè)組分。
 

TANGO6在不同細(xì)胞周期的分布及其亞細(xì)胞定位^[1]

2 TANGO6拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)鑒定
為了進(jìn)一步探究TANGO6是如何錨定在COPI囊泡上的，研究人員通過(guò)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)其存在信號(hào)錨以及跨膜結(jié)構(gòu)域，并且通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)TANGO6的N端以及C端均定位在細(xì)胞漿中，通過(guò)一個(gè)信號(hào)錨以及兩個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域錨定在COPI囊泡上，從而隨著COPI囊泡運(yùn)動(dòng)。
 

TANGO6拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)鑒定^[1]

3 TANGO6入核過(guò)程解析
接下來(lái)，研究人員解析了TANGO6是如何入核的。首先，他們發(fā)現(xiàn)TANGO6的N端存在一段核定位序列，并通過(guò)點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)證實(shí)其252位的精氨酸對(duì)其入核至關(guān)重要。隨后，通過(guò)免疫共沉淀以及siRNA干擾技術(shù)，研究者發(fā)現(xiàn)TANGO6的入核需要SNARE復(fù)合體介導(dǎo)的膜融合到達(dá)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，并在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)駐留蛋白LRRC59的幫助下到達(dá)核孔，并與核輸入蛋白KPNB1互作進(jìn)入核內(nèi)。
 

TANGO6入核過(guò)程^[1]

4 通過(guò)質(zhì)譜挖掘與TANGO6相互作用蛋白R(shí)PB2
那么TANGO6入核的生物學(xué)意義是什么？研究人員推測(cè)其像一輛貨車(chē)運(yùn)載相應(yīng)的貨物進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)。因此，他們做了質(zhì)譜檢測(cè)與TANGO6相互作用的蛋白，從中發(fā)現(xiàn)了RPB2。進(jìn)一步，當(dāng)敲降TANGO6后會(huì)導(dǎo)致RPB2累積在細(xì)胞漿中，無(wú)法入核。從而揭示了TANGO6重要的生物學(xué)功能之一是攜帶RPB2進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)。
 

TANGO6介導(dǎo)RPB2入核^[1]

5 TANGO6-RPB2信號(hào)軸保守性驗(yàn)證
最后，研究者分析了在血液細(xì)胞中條件性敲除Tango6（Vav-iCre/Tango6^flox/flox，cKO）小鼠表型（由賽業(yè)生物提供），發(fā)現(xiàn)該小鼠造血干細(xì)胞產(chǎn)生不受影響，但在HSCs的擴(kuò)增期（E12.5-E16.5）cKO小鼠通體變白，胎肝變小無(wú)血色。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)發(fā)現(xiàn)造血干細(xì)胞的數(shù)量（LSK and SLAM-HSCs）在突變體中顯著降低，并且通過(guò)抗體染色發(fā)現(xiàn)cKO小鼠HSCs中RPB2入核同樣受阻，表明TANGO6-RPB2信號(hào)軸在生物體內(nèi)的重要功能之一是調(diào)控HSCs的擴(kuò)增。并且，當(dāng)在血液細(xì)胞中過(guò)表達(dá)Tango6后會(huì)導(dǎo)致HSCs數(shù)目增加，提示Tango6作為HSCs的關(guān)鍵因子調(diào)控其擴(kuò)增過(guò)程。
 

條件性敲除Tango6小鼠表型分析^[1]

研究結(jié)論
該研究以TANGO6為切入點(diǎn)，揭示了對(duì)于囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)，特別是COPI囊泡對(duì)于細(xì)胞增殖的重要性，這是對(duì)整個(gè)細(xì)胞增殖網(wǎng)絡(luò)的重要補(bǔ)充，進(jìn)而為實(shí)現(xiàn)有效在體外擴(kuò)增干細(xì)胞或并將其作為潛在治療靶點(diǎn)來(lái)緩解和治療腫瘤提供理論指導(dǎo)。

參考文獻(xiàn)：
[1]Feng, Z., Liu, S., Su, M., Song, C., Lin, C., Zhao, F., Li, Y., Zeng, X., Zhu, Y., Hou, Y., Ren, C., Zhang, H., Yi, P., Ji, Y., Wang, C., Li, H., Ma, M., Luo, L., & Li, L. (2024). TANGO6 regulates cell proliferation via COPI vesicle-mediated RPB2 nuclear entry. Nature communications, 15(1), 2371. https://doi.org/10.1038/s41467-024-46720-y
 

Tango6 KO小鼠

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品系名稱(chēng)：
C57BL/6NCya-Tango6^em1/Cya
產(chǎn)品編號(hào)：
S-KO-08860
應(yīng)用方向：
發(fā)育生物學(xué),神經(jīng)系統(tǒng),眼科,細(xì)胞生物學(xué)
 

Tango6 flox小鼠

品系名稱(chēng)：
C57BL/6JCya-Tango6^em1flox/Cya
產(chǎn)品編號(hào)：
S-CKO-09980
應(yīng)用方向：
發(fā)育生物學(xué),神經(jīng)系統(tǒng),眼科,細(xì)胞生物學(xué)