牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞(dental pulp mesenchymal stem cells，DPMSCs)屬于被定義較晚的一種間充質(zhì)干細(xì)胞類(lèi)型，它從健康成人第三磨牙中發(fā)現(xiàn)，從此改變了脫落牙齒和拔除智齒作為口腔醫(yī)療廢棄物的固定標(biāo)簽，并成為MSCs研究的主要來(lái)源，變廢為寶。

DPMSCs是一種具有高度增殖能力和多向分化潛能的間充質(zhì)干細(xì)胞，具有來(lái)源豐富、取材安全方便、不涉及倫理學(xué)問(wèn)題、免疫原性低等優(yōu)點(diǎn)，在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域取得了很大進(jìn)展，具有廣闊的應(yīng)用前景。

國(guó)內(nèi)首個(gè)申報(bào)牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞的注射液的新藥臨床實(shí)驗(yàn)在2020年8月獲得臨床默示許可，并在今年5月順利進(jìn)入II期臨床^[2]。該注射液的有效成分是人牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞，臨床用于治療慢性牙周炎。
 

應(yīng)用前景如此廣泛，取料獲取也不難的
牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞
應(yīng)該如何獲得呢？

此前我們已經(jīng)為大家介紹了一種取材方法
請(qǐng)隨我們往下看，
還有另兩條羅馬大道~

材料準(zhǔn)備

· 組織樣本: 無(wú)齲齒的健康智齒或自然脫落的乳牙。
· 實(shí)驗(yàn)試劑:OriCell^®PBS緩沖液(1X), OriCell^®人牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞完全培養(yǎng)基, OriCell^®胰蛋白酶細(xì)胞消化液（0.25%），OriCell^®I型膠原蛋白酶(0.1%) ，OriCell^®青霉素-鏈霉素溶液（100X）。
· 器具耗材：細(xì)胞培養(yǎng)皿，眼科鑷，牙科鉗，牙科錘。

牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞的獲得

1. 將0.1%的I型膠原酶預(yù)熱至37℃。
2. 將牙髓組織剪碎至1mm2大小，利用離心管收集牙髓組織，常溫條件下265g離心力，離心5min。
3. 棄上清，使用5mL的0.1% I型膠原酶重懸牙髓組織，置于37℃水浴中消化20min，期間每5min取出充分搖勻，或者有條件可以使用恒溫?fù)u床進(jìn)行消化。
4. 消化完成后加入等體積的完全培養(yǎng)基，完全混勻消化懸液和完全培養(yǎng)基。
5. 265g離心5min，棄上清，使用預(yù)熱的OriCell^®人牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接種至培養(yǎng)皿中。
6. 接種完成后盡量不要移動(dòng)培養(yǎng)皿，72h后觀察細(xì)胞狀態(tài)，之后視情況進(jìn)行換液，待細(xì)胞匯集率達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代。

注意事項(xiàng)
直接貼壁或者胰酶消化法均可獲得牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞，但是如果使用的實(shí)驗(yàn)材料是乳牙，建議使用直接貼壁法，以增加細(xì)胞得率。因?yàn)槿檠姥浪璺浅４嗳跫八绍�，且組織較小，使用貼壁法可以盡量減少操作時(shí)間，避免步驟過(guò)多，牙髓組織有額外損失。

牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞的傳代
人牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)至80%-90%融合度時(shí)，就應(yīng)該進(jìn)行傳代。不可讓人牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞完全融合或者過(guò)度融合，否則會(huì)出現(xiàn)接觸抑制，嚴(yán)重影響細(xì)胞生長(zhǎng)。

傳代操作
1. 將完全培養(yǎng)基、0.25%胰酶預(yù)熱至37℃。
2. 吸去培養(yǎng)液，用1×PBS洗滌細(xì)胞2-3次以去除殘留的血清，吸去PBS。
3. 加入適量0.25%胰酶，輕輕旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)皿，使胰酶覆蓋細(xì)胞表面，消化1-2min，顯微鏡下可見(jiàn)細(xì)胞間隙增大、 變圓（以顯微鏡下所見(jiàn)為消化依據(jù)）。用手輕拍培養(yǎng)器皿的壁，當(dāng)大約有80％細(xì)胞脫壁浮起時(shí)，立即加入2-3mL完全培養(yǎng)液終止消化。
注意：總的消化時(shí)間不可太長(zhǎng)。因?yàn)閷?duì)于間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)說(shuō)，其消化脫壁的時(shí)間應(yīng)該較短，難以消化脫壁的細(xì)胞可能多數(shù)不是間充質(zhì)干細(xì)胞，而是其他的雜細(xì)胞。
4. 將細(xì)胞移入離心管中，再向培養(yǎng)瓶中加入1×PBS洗1-2次，同樣轉(zhuǎn)移至離心管中。
5. 265g離心4min，吸去上清液后用2-3mL完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。
6. 按照細(xì)胞量或按照2×10⁴個(gè)細(xì)胞/cm²的密度接種細(xì)胞。
7. 加入完全培養(yǎng)基，在 37℃、5%CO₂、95%相對(duì)濕度的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。
 

以上就是人牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞的提取和傳代方案啦，大家都學(xué)會(huì)了嗎？

OriCell^®牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞完整解決方案
作為已經(jīng)有17年干細(xì)胞培養(yǎng)經(jīng)驗(yàn)的專(zhuān)家，賽業(yè)OriCell^®可提供DPMSCs完整解決方案：

此外，針對(duì)骨髓、脂肪、臍帶、臍血來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞，賽業(yè)OriCell^®亦提供完整解決方案，如有需要，歡迎聯(lián)系我們咨詢(xún)訂購(gòu)。

參考文獻(xiàn)
1. GRONTHOS S，MANKANI M，BRAHIM J，et al.Postnatal human dental pulp stem cells(DPSCs)in vitro and invivo.Proc Natl Acad Sci USA，2000，97(25)：13625-13630.

2. 中源協(xié)和細(xì)胞基因工程股份有限公司關(guān)于參股子公司藥物進(jìn)入Ⅱ期臨床試驗(yàn)的公告（公告編號(hào)：2023-022，2023年5月25日）。