「訪談實錄」
LDLR位點基因突變引發(fā)動脈粥樣硬化
動脈粥樣硬化是一種慢性免疫代謝炎癥性疾病，臨床上被廣泛稱為“壞膽固醇”的低密度脂蛋白（LDL）升高在動脈粥樣硬化發(fā)展中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。而炎癥反應(yīng)、吸煙、高血壓和糖尿病則極大增加了該疾病發(fā)生的風險。

血漿中LDL的過量積累，激活了巨噬細胞參與，誘發(fā)血管內(nèi)皮的慢性炎癥過程，巨噬細胞攝取LDL后，最終形成了所謂的“泡沫細胞”，該類細胞在斑塊內(nèi)的聚集，不僅增加了動脈血管厚度與硬度，也引起血管內(nèi)皮層功能障礙，促進了動脈粥樣硬化發(fā)展。如此炎癥環(huán)境也加劇了斑塊的不穩(wěn)定性，增加了斑塊破裂的風險，最終誘發(fā)嚴重的心腦血管疾病，導(dǎo)致心肌梗死、缺血性中風，以及外周動脈等疾病。

家族性高膽固醇血癥（FH）被證實是低密度脂蛋白受體（LDLR）基因突變，導(dǎo)致LDLR缺乏，引起LDL升高等代謝異常的一種罕見遺傳病。FH患者體內(nèi)LDL的過量積累，造成血管壁粥樣硬化性斑塊形成，導(dǎo)致血管狹窄、阻塞，從而誘發(fā)患者心肌梗死等心腦血管疾病。

通過發(fā)現(xiàn)臨床FH患者LDLR基因點突變的新位點，我們客戶周斌教授模擬人突變位點，借助CRISPR/Cas9技術(shù)，成功建立了Ldlr-E208X點突變小鼠模型，并證實該基因突變新位點，可引起小鼠包括總膽固醇、Ldl和甘油三酯等升高，以及主動脈弓斑塊形成等動脈炎粥樣硬化病變發(fā)生。且應(yīng)用注射AAV9病毒肝特異性表達Ldlr的基因療法，實現(xiàn)小鼠體內(nèi)Ldlr功能部分修復(fù)作用。

野生小鼠先天抵抗動脈粥樣硬化形成
動脈粥樣硬化相關(guān)小鼠模型的應(yīng)用研究最早始于1960年代，通過給小鼠提供30%高脂肪、5%高膽固醇和2%膽酸飲食策略，成功誘導(dǎo)小鼠高膽固醇血癥發(fā)生，并觀察到不同血管部位脂肪條紋形成，也觀察到急性高強度炎癥反應(yīng)的出現(xiàn)，但卻無法模擬人動脈粥樣硬化的那種慢性低強度的炎癥環(huán)境現(xiàn)象。

如果改用低毒性15%脂肪、1.25%膽固醇和0.5%膽酸飲食策略，在誘導(dǎo)3-9個月后，動脈粥樣硬化病變形成在不同小鼠品系中出現(xiàn)的差異性較大，卻以小鼠主動脈弓出現(xiàn)小范圍的脂肪條紋和無纖維化斑塊形成為特征。

基于單獨應(yīng)用高脂肪飲食策略誘導(dǎo)存在的問題和相關(guān)病變出現(xiàn)差異等因素，使得只用飲食策略誘導(dǎo)野生小鼠發(fā)生動脈粥樣硬化變得非常困難。

需要提醒的是，由于小鼠本身的某些生理特征，決定了小鼠先天就對動脈粥樣硬化不易感。比如，1. 小鼠膽固醇組成中是以高密度脂蛋白（HDL）為主，LDL含量較低，使其總膽固醇含量維持在較低水平。而人則正好相反。2. 小鼠缺乏膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白（CETP），人卻有該蛋白，該蛋白是促進膽固醇酯由HDL向極低密度脂蛋白（VLDL）轉(zhuǎn)運作用。3. 與人比較，小鼠腸道吸收膽固醇能力也較弱，導(dǎo)致小鼠內(nèi)源性膽固醇合成增加。4. 小鼠能產(chǎn)生額外的α-和β-鼠膽酸，該鼠膽汁酸促進小鼠腸道排泄膽固醇；5. 小鼠APOE沒有其它變體亞型，而人APOE存在不同變體亞型，比如APOE2、E3和E4。

C57BL/6J小鼠是最常用的較易感動脈粥樣硬化小鼠品系
不同近交系小鼠品系對動脈粥樣硬化發(fā)生的易感性存在差異。實驗比較的十種近交系小鼠結(jié)果表明，C57BL/6J為最為常用較易感的動脈粥樣硬化品系小鼠。C57BL/6小鼠更容易誘發(fā)肥胖、糖尿病，以及炎癥損傷現(xiàn)象。

有比較研究表明，C57BL/6小鼠有相對較低的HDL，而BALB/c和C3H小鼠的HDL則相對較高。在誘導(dǎo)T細胞因子方面，C57BL/6小鼠主要誘導(dǎo)Th1 T細胞因子，特別是高水平的IFN-γ。Th1 T細胞可促進動脈粥樣硬化形成作用。而BALB/c小鼠誘導(dǎo)Th2 T細胞因子，產(chǎn)生較低水平的IFN-γ。

西方飲食誘導(dǎo)促進動脈粥樣硬化形成
為了加速動物粥樣硬化形成，多數(shù)情況下，實驗動物需要提供促動物粥樣硬化飲食，即典型的高脂肪和高膽固醇飲食，通常稱之為西方飲食。通常正常標準飲食（chow）含脂肪為4～6%，膽固醇為小于0.03%；而西方飲食則以模擬西方人每日飲食習慣為標準，即21%脂肪加上0.15%膽固醇的組合策略。

該種西方飲食不僅有明顯促進動脈粥樣硬化形成的作用，也常常被應(yīng)用于誘導(dǎo)肥胖和代謝綜合癥小鼠模型實驗中。需要特別強調(diào)的是，短期提供高脂肪飲食，不僅可顯著影響到小鼠的免疫系統(tǒng)，也會影響腸道微生物。另外，還需要提醒的是，由于各種不同配方的西方飲食在不同實驗中應(yīng)用中，因其關(guān)鍵成分來源差異，可能會影響到研究結(jié)果的重復(fù)性與可比性。

所以，是否應(yīng)用西方飲食策略不是一個輕松簡單的選擇。一方面，該種飲食方式更接近該疾病患者的飲食生活習慣。另一方面，此種西方飲食也可能影響到某些細胞的一系列連鎖反應(yīng)，從而增加了研究鑒別各種影響作用特征的復(fù)雜性與難度。盡管如此，在建立實驗標準化與縮短動脈粥樣硬化進程方面，應(yīng)用西方飲食仍是非常有用的誘導(dǎo)策略。

Apoe敲除與Ldlr敲除小鼠為最常用動脈粥樣硬化小鼠模型
小鼠成為研究動脈粥樣硬化的主要動物模型是從1990年代開始，目前最為常用的動脈粥樣硬化小鼠模型為Apoe敲除（約占研究70%）和Ldlr敲除（約占27%）。

APOE為許多脂蛋白顆粒的結(jié)構(gòu)糖蛋白，主要作為受體介導(dǎo)攝取的配體，在乳糜微粒和VLDL殘留清除方面發(fā)揮重要作用。雖然主要在肝和大腦合成，也可由單核細胞和巨噬細胞產(chǎn)生。

Apoe敲除小鼠于1992年成功構(gòu)建，表現(xiàn)為血漿總膽固醇增高（主要為乳糜顆粒/VLDL）。用常規(guī)標準chow飲食，小鼠可出現(xiàn)復(fù)雜的動脈粥樣硬化病變，包括嚴重高膽固醇血癥與免疫調(diào)節(jié)功能的損害。血管病變主要位于主動脈弓和沿主動脈的不同分支點。如果用西方飲食策略，小鼠血漿總膽固醇水平，會比用常規(guī)普通Chow飲食，增加高出3倍以上。

Apoe敲除小鼠模型優(yōu)勢為不需要西方飲食誘導(dǎo)，即可誘發(fā)小鼠出現(xiàn)明顯動脈粥樣硬化病變。然而，該模型特點是以VLDL作為血漿脂代謝主要成分，與人以LDL為主的脂代謝異常特征有一定差異。另外，APOE本身除了發(fā)揮介導(dǎo)脂蛋白清除作用外，也具有其它功能，比如抗氧化、抗增殖、抗炎癥等作用。因此，Apoe敲除小鼠引起的動脈粥樣硬化病變，可能不僅僅是依賴于血漿脂質(zhì)水平的改變。

Ldlr敲除小鼠模型成功構(gòu)建，在一定程度上，克服了Apoe敲除小鼠的不足之處。比如，與Apoe比較，Ldlr的功能作用相對單一。缺乏ldlr引起的動脈粥樣硬化，則更多與LDL脂蛋白穩(wěn)態(tài)的改變密切相關(guān)。LDLR作為細胞表面受體，結(jié)合apoB100蛋白，參與介導(dǎo)LDL膽固醇的內(nèi)吞作用，達到清除LDL目的。與APOE比較，人群中LDLR缺失更為常見，該基因突變是引起家族性高膽固醇血癥的致病原因。

Ldlr敲除小鼠于1993年構(gòu)建成功，表現(xiàn)為血漿LDL膽固醇水平適度增加。用標準chow飲食時，小鼠要到12-15月齡時，才會出現(xiàn)明顯的動脈粥樣硬化病變。而用西方飲食誘導(dǎo)時，小鼠高膽固醇血癥明顯，且可出現(xiàn)大的動脈粥樣硬化斑塊。通常情況下，脂代謝與免疫系統(tǒng)損害不太明顯。因此，Ldlr敲除小鼠常采用高脂飲食誘導(dǎo)策略，以加速斑塊形成。

Ldlr敲除小鼠模型模擬了人家族性高膽固醇血癥臨床特征，包括主動脈瓣和主動脈根部損傷。另外，該模型也有助于探討動脈粥樣硬化與糖尿病之間的相互關(guān)系。有研究表明，與Apoe敲除小鼠比較，Ldlr敲除小鼠更易發(fā)生肥胖和胰島素耐受現(xiàn)象。

Ldlr敲除小鼠模型也不是完美的。由于需要用西方飲食以加速動脈粥樣硬化形成，而高膽固醇飲食誘導(dǎo)策略增加了實驗結(jié)果的可變性，使得不同實驗室結(jié)果進行標準化比較的難度也大大增加了。

Apoe敲除與Ldlr敲除小鼠模型比較
前面說過APOE基因的多功能特征，比如不僅具有脂蛋白轉(zhuǎn)移功能，也在其他方面（如血腦屏障的形成、血管功能、以及重要的免疫調(diào)節(jié)等）都發(fā)揮了一定作用。缺乏AOPE可能導(dǎo)致膽固醇轉(zhuǎn)移紊亂，細胞增殖增加，以及全身性白細胞增多等。

與Ldlr敲除小鼠比較，Apoe敲除小鼠因呈現(xiàn)更高的炎癥反應(yīng)水平，故也展現(xiàn)更多且明顯的表型。Ldlr敲除小鼠中則呈現(xiàn)較弱脂代謝異常和免疫系統(tǒng)方面表型，這也許可被認為是該模型的某種優(yōu)勢。但是，Ldlr敲除小鼠更不容易發(fā)生損傷誘導(dǎo)的新生內(nèi)膜形成。所以，Apoe敲除小鼠在研究血管成形術(shù)后潛在的再狹窄分子機制方面，仍然是一個更好的模型選擇。

用標準chow飲食時，Apoe敲除小鼠比Ldlr敲除小鼠更快出現(xiàn)明顯表型。因此，Apoe敲除小鼠模型實際應(yīng)用中，不需要考慮不同飲食喂養(yǎng)干預(yù)的復(fù)合影響因素。但我們也需要清醒認識到，Apoe敲除小鼠不需要高脂飲食來誘發(fā)動脈粥樣硬化斑塊形成，但人的動脈粥樣硬化發(fā)展卻是與西方飲食習慣密切相關(guān)。單基因突變的家族性高膽固醇血癥與LDLR基因突變相關(guān)性在人群中為1/200比例，雖然APOE突變也存在于一定人群中，比例卻相對較低。但兩種小鼠模型都被認為與人疾病密切相關(guān)。

考慮到高脂肪高碳水化物（富含葡萄糖或蔗糖）飲食方式，也是誘導(dǎo)C57BL/6小鼠肥胖和II型糖尿�。═2D）小鼠模型常用方法。研究表明，在該類飲食誘導(dǎo)策略下，Ldlr敲除小鼠較Apoe敲除和野生型小鼠更易發(fā)生T2D。所以，該兩種敲除小鼠模型有助于揭示與動脈粥樣硬化相關(guān)的代謝合并癥。然而，不同實驗室間在誘導(dǎo)特定疾病模型的實際研究中，由于飲食組成及誘導(dǎo)策略的易變性，使得相關(guān)實驗結(jié)果的可比性與可重復(fù)性成為一種挑戰(zhàn)。

雖然兩種敲除小鼠都對鏈脲霉素（STZ）誘導(dǎo)糖尿病表型發(fā)生敏感，有報道表明，經(jīng)STZ處理的Apoe敲除小鼠，與STZ處理的Ldlr敲除小鼠比較，有明顯促進動脈粥樣硬化發(fā)生作用。提示APOE具有抵消糖尿病介導(dǎo)的危險作用。另外，研究也表明，這兩種敲除小鼠除了有脂蛋白轉(zhuǎn)移功能方面的缺陷外，也都表現(xiàn)一些其它代謝性和行為學(xué)方面的異常。

Apoe敲除和Ldlr敲除小鼠與其他小鼠模型的聯(lián)合應(yīng)用
這兩種敲除小鼠都有與其他相關(guān)小鼠交配，以研究代謝相關(guān)疾病的報道。比如，與Akita小鼠模型交配，因該小鼠存在胰島素編碼基因Ins2突變，導(dǎo)致胰島素蛋白折疊錯誤，引起beta細胞程序性死亡增加。與Akita小鼠交配后，這兩種敲除小鼠表現(xiàn)更加顯著血管炎癥和動脈粥樣硬化表型，特別是雄性小鼠。這可能與雄性Akita小鼠的遺傳背景影響其血壓及其腎臟損傷有關(guān)。

這兩種敲除小鼠分別與相關(guān)肥胖小鼠交配，比如ob/ob和db/db小鼠，以探討實驗性動脈粥樣硬化發(fā)展過程中，代謝綜合癥相關(guān)因素的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Apoe和Ldlr敲除小鼠均出現(xiàn)肥胖、高脂血癥和T2D，即使用標準chow飲食，隨后也觀察到高膽固醇血癥及動脈粥樣硬化病變加速形成。

ApoE*3‑Leiden轉(zhuǎn)基因小鼠和SRB‑1/Apoe雙基因敲除小鼠也應(yīng)用許多研究。用西方飲食誘導(dǎo)，ApoE*3‑Leiden小鼠模型可出現(xiàn)嚴重高膽固醇血癥。如果與人CETP轉(zhuǎn)基因小鼠交配，表現(xiàn)更接近人脂蛋白膽固醇分布情況。Apoe^-/-; Fbn1C1039G^+/‑雙基因敲除小鼠模型則表現(xiàn)為易損的動脈粥樣硬化斑塊形成，導(dǎo)致斑塊更易破裂發(fā)生。該模型為研究人不穩(wěn)定性斑塊特征提供了工具。

考慮到血脂異常合并癥，此兩種敲除小鼠模型也被應(yīng)用于研究非酒精性脂肪性肝炎誘發(fā)易感性。非酒精性脂肪性肝炎是一種表現(xiàn)為肝脂肪變性、炎癥、肝損傷和肝纖維化等特征的疾病過程。相對于Apoe敲除小鼠，Ldlr敲除小鼠具有增加肝臟炎癥反應(yīng)、程序性死亡和肝纖維化等發(fā)生的作用。

誘導(dǎo)高脂血癥小鼠模型的新策略
PCSK9基因功能獲得性突變（gain of function）特征在人群中的發(fā)現(xiàn)，不僅有益于開發(fā)治療心血管疾病的新方法（比如PCSK9抑制劑），也為建立高膽固醇血癥小鼠模型提供了新策略。PCSK9基因在肝臟高表達，存在于血循環(huán)中，與LDLR結(jié)合后，促進LDLR的降解，從而介導(dǎo)高膽固醇血癥。而PCSK9功能性缺失突變體D374Y（DY）則具有抑制其正常功能的作用。因此，通過表達人PCSK9-DY突變體來建立動脈粥樣硬化小鼠模型的優(yōu)勢在于，無需進行小鼠生殖細胞相關(guān)編輯，因而降低了小鼠模型構(gòu)建的技術(shù)門檻與成本。

借助腺相關(guān)病毒（AAV）尾靜脈注射方法，建立長期肝表達人PCSK9-DY突變體小鼠模型表明，用標準chow飲食，小鼠膽固醇水平適度增加。而用西方飲食誘導(dǎo)策略，PCSK9 DY-AAV小鼠加劇的高脂血癥與明顯血管病變形成。除了觀察到有巨噬細胞侵潤和纖維化組織形成外，還伴有泡沫細胞和平滑肌細胞的存在，小鼠主動脈根病變以晚期斑塊形成為特征。

我們客戶梁思佳教授應(yīng)用AAV8表達人PCSK9-DY突變體，經(jīng)尾靜脈注射至NFATc3巨噬細胞特異性敲除小鼠的研究證實，NFATc3基因在巨噬細胞中的缺失，加速了PCSK9-DY誘導(dǎo)動脈粥樣硬化病變的形成與發(fā)展。

動脈粥樣硬化小鼠模型的局限性及其影響因素
應(yīng)用小鼠模型建立動脈粥樣硬化形成的局限性，除了前面描述的小鼠先天抵抗動脈粥樣硬化發(fā)生的某些特征外，也表現(xiàn)在下面幾個方面，1. 小鼠冠狀動脈太小，不易觀察到，收集血液也比較困難。2. 考慮到小鼠與人在心血管系統(tǒng)解剖方面的不同差異，小鼠動脈內(nèi)膜組成只含有內(nèi)彈性層上的內(nèi)皮細胞，且血管中膜也更薄且無血管滋養(yǎng)管；而人則含有平滑肌細胞或結(jié)締組織和血管滋養(yǎng)管等。3. 小鼠模型觀察的動脈粥樣硬化病變形態(tài)學(xué)不同于人，比如小鼠無厚纖維帽形態(tài)出現(xiàn)。4. 小鼠動脈粥樣硬化病變部位為主動脈和頸動脈，而人則發(fā)生在冠狀動脈。5. 小鼠模型很少見非穩(wěn)定斑塊現(xiàn)象，即很少發(fā)生斑塊病變破裂，而這是導(dǎo)致人急性梗塞發(fā)生，誘發(fā)心血管疾病死亡的主要直接原因。

關(guān)于小鼠斑塊病變很少破裂發(fā)生的現(xiàn)象，有研究者認為，在多數(shù)小鼠模型研究的有限觀察范圍時期內(nèi)，要想發(fā)現(xiàn)動脈粥樣硬化血栓形成的情況是很難的。有最新研究表明，如果對高膽固醇血癥小鼠模型進行較長時間的實驗觀察，可在小鼠冠狀動脈觀察到動脈粥樣硬化血栓形成的跡象。所以，那種認為動脈粥樣硬化小鼠模型不能表現(xiàn)斑塊破裂、心肌梗死和缺血性中風等表型是某種誤解。然而，需要承認的是，在模擬人斑塊病變破裂方面，動脈粥樣硬化小鼠模型中斑塊病變部位的不同分布與生物力學(xué)等特性方面，并非為最優(yōu)模型選擇。

另外，我們也需要明白的是，動脈粥樣硬化小鼠模型應(yīng)用研究的結(jié)果，也會受到如下許多因素的影響。1. 小鼠遺傳背景，比如C57BL/6J表型較Balb/c、129/J和FVB等都更加明顯。2. 研究關(guān)注點差異，小鼠模型多數(shù)研究只關(guān)注病變損傷區(qū)域大小，而忽略其他相關(guān)因素，比如單核白細胞、平滑肌細胞、淋巴細胞、鈣化沉積物、膠原蛋白和壞死細胞碎片等。3. 性別因素，通常見雌性小鼠病變嚴重，而人則是男性患者更嚴重；4. 研究策略，多為基因全身敲除或高脂飲食誘導(dǎo)，導(dǎo)致從多基因與信號通路收到影響，可能引起旁路方式而非直接作用效果；5. 其它可變因素，不同小鼠模型、研究方法與技術(shù)、飼料/飲食組成、研究時間長短、鼠齡、飼養(yǎng)環(huán)境，以及小鼠研究數(shù)量等。

「專家簡介」

俞曉峰博士
賽業(yè)生物中國區(qū)副總裁兼首席科學(xué)家

軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院博士，國際知名模式動物和細胞生物學(xué)專家，耶魯大學(xué)醫(yī)學(xué)院和紐約大學(xué)醫(yī)學(xué)院研究員，美國基因打靶公司（iTL）和應(yīng)用干細胞公司（ASC）資深科學(xué)家。在基因修飾模式動物領(lǐng)域有超過20多年研發(fā)與管理等方面的豐富經(jīng)驗，在干細胞相關(guān)領(lǐng)域及哺乳動物細胞系基因改造研究也取得了巨大成就，其研究成果多次發(fā)表在Nat Immunol、Hum Mol Genet、Mol Cell Biol等高水平雜志上。

小鼠模型相關(guān)參考資料：
[1]【技術(shù)連載】俞曉峰：Cre-loxP位點特異性重組系統(tǒng)在小鼠條件性靶基因功能研究中的應(yīng)⽤，2021-10-1，生物通
[2]【專訪】俞曉峰：小鼠疾病模型構(gòu)建與藥物臨床前評價研究的思考，2021-5-10，中國實驗動物信息網(wǎng)
[3]【專訪】俞曉峰：小鼠模型在人冠狀病毒感染性疾病中的應(yīng)⽤研究，2020-3-20，中國實驗動物信息網(wǎng)
[4]【專家分享】俞曉峰:人源抗體基因小鼠研發(fā)及其在治療疾病中的應(yīng)用，2020-7-13，丁香園
[5]【專訪】俞曉峰：無菌小鼠及腸道微生物移植小鼠模型在⼈相關(guān)疾病研究中的應(yīng)⽤，2019-9-09，中國實驗動物信息網(wǎng)
[6]【專訪】俞曉峰：人源化基因修飾小鼠模型的研制及其應(yīng)⽤進展，2018-10-30，中國實驗動物信息網(wǎng)
[7]【專訪】俞曉峰：人源化小鼠模型在人類疾病研究中的應(yīng)⽤，2018-4-19，中國實驗動物信息網(wǎng)