內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）是蛋白質(zhì)生物合成和折疊的場所，也是蛋白質(zhì)發(fā)生糖基化修飾和裂解的場所。同時，它還是細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的調(diào)節(jié)器，而鈣離子在許多生理過程中發(fā)揮著重要作用，如心臟和肌肉收縮、神經(jīng)信號傳導(dǎo)、細(xì)胞增殖和凋亡等。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通過蘭尼堿受體（RyR）和三磷酸肌醇受體（IP3R）釋放鈣離子，并通過質(zhì)子泵SERCA回收鈣離子。鈣離子跨內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的流動會帶來電勢變化，需要其他離子來中和這種電荷積累。目前已經(jīng)證實內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鉀離子通道TRIC的存在，但一價鉀離子無法同時抵消二價鈣離子釋放產(chǎn)生的電勢差。因此，科學(xué)家們推測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上同時存在一個陰離子通道，但一直未找到。

近日，清華大學(xué)醫(yī)學(xué)院賈怡昌團隊、中科院上海藥物研究所高召兵團隊和北京大學(xué)第三醫(yī)院樊東升團隊合作，首次證實CLCC1正是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位的氯離子通道的孔道形成組分。它能夠協(xié)助內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的鈣離子釋放并調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的離子穩(wěn)態(tài)，而CLCC1功能缺失會造成內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫，并引發(fā)與肌萎縮性側(cè)索硬化癥（ALS）相關(guān)的病理變化。

這篇題為“Disruption of ER ion homeostasis maintained by an ER anion channel CLCC1 contributes to ALS-like pathologies”的論文于5月4日發(fā)表在《Cell Research》雜志上，并作為研究亮點（Research Highlight）被重點推薦。
 

圖片來源：《Cell Research》
（https://www.nature.com/articles/s41422-023-00798-z）

研究材料與方法
在這項研究中，研究人員使用了293FT細(xì)胞和小鼠原代神經(jīng)元，并構(gòu)建了多個突變敲入小鼠品系。研究人員還利用賽業(yè)生物提供的Clcc1 floxed小鼠，構(gòu)建了條件性敲除Clcc1小鼠。他們利用多個探針測定了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的靜息態(tài)氯離子、鉀離子和鈣離子濃度，并利用透射電鏡（TEM）觀察了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)。他們還通過電生理學(xué)、鈣成像等一系列實驗驗證了CLCC2突變對功能的影響。

技術(shù)路線
01通過單通道電生理檢測確認(rèn)CLCC1是陰離子通道的孔道形成組分，并發(fā)現(xiàn)抑制鈣離子活性的關(guān)鍵殘基
02探究CLCC1如何調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中氯離子、鉀離子和鈣離子的穩(wěn)態(tài)
03分析與ALS相關(guān)的罕見突變?nèi)绾斡绊慍LCC1通道活性

研究結(jié)果
1.CLCC1是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上陰離子通道的孔道形成組分
之前的研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)駐留蛋白CLCC1的缺失會造成內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫和神經(jīng)退行性變。不過CLCC1與氯離子通道CLIC家族成員的序列相似性很小。在此次研究中，研究人員證實CLCC1定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，并形成了同源二聚體。將純化的全長mCLCC1蛋白加入脂質(zhì)雙分子層后，他們發(fā)現(xiàn)CLCC1可以介導(dǎo)陰離子流，但不通透納、鉀、鈣等陽離子。這表明，CLCC1是陰離子通道的孔道形成組分。

研究人員進一步分析后發(fā)現(xiàn)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)的高濃度鈣離子會抑制CLCC1通道的活性。為了確定負(fù)責(zé)鈣離子抑制的關(guān)鍵殘基，他們對N端幾個保守的帶負(fù)電殘基進行了分析，發(fā)現(xiàn)D25和D181是負(fù)責(zé)CLCC1通道的鈣離子抑制活性的關(guān)鍵殘基。D25E/D181R突變的CLCC1會顯著破壞與鈣離子的結(jié)合親和力。

2.CLCC1調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中多種離子的穩(wěn)態(tài)
為了研究CLCC1是否參與調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的離子穩(wěn)態(tài)，研究人員使用了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位的比率型氯離子探針（RaMorideER）和比率型鉀離子探針（RaMssiumER）。他們發(fā)現(xiàn)，在敲低293FT細(xì)胞的CLCC1后，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的靜息態(tài)氯離子濃度（[Cl^–]_ER）和鉀離子濃度（[K⁺]_ER）升高。通過透射電鏡（TEM）觀察，他們發(fā)現(xiàn)對照組的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)呈現(xiàn)細(xì)長結(jié)構(gòu)，而CLCC1敲低后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)則呈現(xiàn)短而粗的形態(tài)，且內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的平均寬度增加（圖1）。這些結(jié)果表明，CLCC1維持著內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中氯離子和鉀離子濃度以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的形態(tài)。
 

CLCC1的缺失導(dǎo)致靜息態(tài)[Cl^–]_ER和[K⁺]_ER升高以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹^[1]

接著，研究人員分析了CLCC1作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的氯離子通道是否參與調(diào)節(jié)鈣離子的釋放。他們發(fā)現(xiàn)，CLCC1的敲低不僅顯著降低了ATP誘導(dǎo)的鈣離子釋放幅度和速度，還削弱了細(xì)胞質(zhì)中的鈣震蕩。后續(xù)的分析表明，CLCC1的敲低以劑量依賴性的方式增加了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的鉀離子濃度和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)容量，并降低了鈣離子濃度，說明CLCC1的劑量對于維持靜息態(tài)鈣離子濃度（[Ca²⁺]_ER）至關(guān)重要。

作為許多離子通道的必要輔因子，細(xì)胞膜上的酸性磷脂PIP2參與了離子通道功能的調(diào)節(jié)。在此，研究人員也發(fā)現(xiàn)，PIP2顯著促進了CLCC1通道的活性，而CLCC1第二個環(huán)內(nèi)的保守殘基K298是關(guān)鍵的PIP2結(jié)合位點。突變體K298A和K298E降低了CLCC1的電導(dǎo)率和開放概率。K298A基因敲入小鼠的大腦表現(xiàn)出內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫，而且脊髓中ChAT+運動神經(jīng)元數(shù)量減少，并表現(xiàn)出嚴(yán)重的運動障礙和后腿肌肉無力，這表明K298A突變對通道功能的破壞會促進內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫和運動神經(jīng)元丟失。

3.與ALS相關(guān)的罕見突變破壞CLCC1通道活性
通過中國ALS患者隊列的外顯子組測序分析，研究人員發(fā)現(xiàn)了CLCC1的8個罕見變異，包括S263R和W267R。與對照相比，帶有S263R或W267R突變的CLCC1增加了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的氯離子濃度，表明S263R和W267R是功能上的有害改變，會破壞通道活性。同時，突變會顯著減少ATP誘導(dǎo)的鈣離子釋放。在S263R和W267R基因敲入小鼠中，研究人員還觀察到錯誤折疊蛋白在丘腦和脊髓中積累，顯示了突變神經(jīng)元更容易出現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫。
 

S263R和W267R突變破壞CLCC1通道功能并促進內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫^[1]

多個Clcc1功能缺失等位基因的表型比較顯示，體內(nèi)疾病表型的嚴(yán)重程度與CLCC1的劑量有關(guān)。10%的K298A雜合小鼠出現(xiàn)了類似ALS的癥狀，表明功能缺失突變以顯性失活的方式誘導(dǎo)了離子通道病。在敲除脊髓ChAT+運動神經(jīng)元中的Clcc1后，小鼠出現(xiàn)運動神經(jīng)元減少、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫、錯誤折疊蛋白積累以及脊髓ALS特征性病變。

研究結(jié)論
總的來說，研究人員首次確定CLCC1是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位的氯離子通道的孔道形成組分，其通道活性受到腔內(nèi)鈣離子的抑制，但受到PIP2的促進。他們還首次將罕見的CLCC1突變與ALS聯(lián)系起來，并證明ALS相關(guān)突變會破壞CLCC1通道活性，破壞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的離子穩(wěn)態(tài)，并引發(fā)大腦中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫。這些結(jié)果意味著，由CLCC1維持的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)離子穩(wěn)態(tài)的破壞是造成神經(jīng)退行性疾病的原因之一。

原文檢索：
[1]Guo, L., Mao, Q., He, J. et al. Disruption of ER ion homeostasis maintained by an ER anion channel CLCC1 contributes to ALS-like pathologies. Cell Res 33, 497–515 (2023). https://doi.org/10.1038/s41422-023-00798-z

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品系名稱：
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品系編號：
KOCMP-229725-Clcc1-B6J-VA
產(chǎn)品編號：
S-KO-06288
應(yīng)用方向：
代謝研究,神經(jīng)系統(tǒng),眼睛,肌肉,生理系統(tǒng),內(nèi)穩(wěn)態(tài)/代謝,行為/神經(jīng)
打靶方案：

 

Clcc1條件性基因敲除小鼠

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品系名稱：
C57BL/6J-Clcc1^em1Cflox/Cya
品系編號：
CKOCMP-229725-Clcc1-B6J-VA
產(chǎn)品編號：
S-CKO-07287
應(yīng)用方向：
代謝研究,神經(jīng)系統(tǒng),眼睛,肌肉,生理系統(tǒng),內(nèi)穩(wěn)態(tài)/代謝,行為/神經(jīng)
打靶方案：