歷經(jīng)多年發(fā)展，嵌合抗原受體CAR-T細(xì)胞療法已成為癌癥治療的革命性方法，其中，CD19靶點(diǎn)藥物在治療B細(xì)胞惡性腫瘤方面更是取得了前所未有的成功，并于2017年獲得美國(guó)FDA批準(zhǔn)。其中，CAR分子設(shè)計(jì)及病毒包裝是影響CAR-T細(xì)胞治療有效性的重要環(huán)節(jié)，在前幾期文章里，我們集中梳理了以下幾個(gè)要點(diǎn)：

• 介紹CAR結(jié)構(gòu)及其設(shè)計(jì)原則
• 盤點(diǎn)CAR-T細(xì)胞治療的局限性及潛在風(fēng)險(xiǎn)
• 如何打破困局、提升治療效果的創(chuàng)新策略

今天結(jié)合具體的研究案例數(shù)據(jù)，為大家展示在實(shí)際的應(yīng)用情境中，我們可以如何更好地了解進(jìn)而優(yōu)化CAR分子設(shè)計(jì)、載體構(gòu)建及病毒包裝等一系列工藝流程。

CAR分子設(shè)計(jì)
CAR分子全稱為嵌合抗原受體，其結(jié)構(gòu)包括信號(hào)肽分子，抗體來源的單鏈可變區(qū)、鉸鏈區(qū)、跨膜區(qū)，共刺激分子結(jié)構(gòu)域、CD3ζ信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)域。

• scFv篩選：scFv親和力和特異性對(duì)CAR分子功能有重要影響，篩選合適的scFv十分重要
• 連接基團(tuán)（Linker）的優(yōu)化：設(shè)計(jì)不同長(zhǎng)度的Linker，使V_H和V_L之間的靈活度增加，進(jìn)而影響結(jié)合親和力
• 鉸鏈區(qū)（Hinge）的優(yōu)化：設(shè)計(jì)不同長(zhǎng)度的Hinge，增加抗原結(jié)合域的空間靈活度
• 共刺激結(jié)構(gòu)域的選擇：可選擇不同的共刺激分子（如4-1BB或CD28等）
• 報(bào)告基因：可連接綠色熒光蛋白基因，表征CAR分子是否轉(zhuǎn)導(dǎo)成功

CAR分子結(jié)構(gòu)示意圖
 

表1 CAR分子設(shè)計(jì)中常用原件

載體構(gòu)建
在設(shè)計(jì)好CAR分子后，通常需要對(duì)其進(jìn)行基因合成并亞克隆至慢病毒穿梭質(zhì)粒上，構(gòu)建后的其結(jié)構(gòu)通常如圖所示。賽業(yè)生物可以提供多種現(xiàn)貨型的CAR慢病毒質(zhì)粒載體庫，靶點(diǎn)包括人的CD19、BCMA、GPC3、FAP和HER2等，且該載體庫還在不斷的豐富和更新中。
 

CAR慢病毒載體結(jié)構(gòu)圖示

病毒包裝和純化
賽業(yè)生物在慢病毒制備方面具有多年的經(jīng)驗(yàn)，可以提供多樣化的慢病毒制備服務(wù)。我們使用了安全性高的第三代慢病毒包裝系統(tǒng)，其制備流程如圖所示。
 

慢病毒包裝技術(shù)路線

解決策略推薦
基于多年在腫瘤免疫領(lǐng)域的研究經(jīng)驗(yàn)，賽業(yè)生物可為CAR-T/其它細(xì)胞治療研究者提供專業(yè)的CAR分子設(shè)計(jì)及載體構(gòu)建、CAR慢病毒制備、靶抗原穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株構(gòu)建等服務(wù)。

• 豐富的CAR分子設(shè)計(jì)經(jīng)驗(yàn)，可提供專業(yè)的各種定制化的CAR分子設(shè)計(jì)服務(wù)
• 豐富的CAR慢病毒質(zhì)粒載體庫，可提供快速優(yōu)質(zhì)的服務(wù)
• 抗原高表達(dá)、高穩(wěn)定性的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株構(gòu)建服務(wù)
• 高滴度高純度的慢病毒制備
• 嚴(yán)格的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)

不僅如此，我們能給予你關(guān)于CAR-T/其他細(xì)胞治療研發(fā)的全方位支持，從抗體開發(fā)、CAR病毒制備、免疫細(xì)胞制備和表型檢測(cè)，到細(xì)胞模型與動(dòng)物模型的構(gòu)建、體外/體內(nèi)藥效評(píng)價(jià)一應(yīng)俱全。

服務(wù)案例

• CD19抗原慢病毒滴度檢測(cè)

將表達(dá)CD19抗原的慢病毒純化液進(jìn)行梯度稀釋（0.01、0.1、1、10μL四個(gè)梯度），分別加入到相同數(shù)量的293T細(xì)胞中，72小時(shí)后流式檢測(cè)293T細(xì)胞陽性率(即被慢病毒感染的293T細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的百分比)，進(jìn)而計(jì)算慢病毒的轉(zhuǎn)導(dǎo)滴度。如圖所示，CD19抗原陽性細(xì)胞的數(shù)量隨轉(zhuǎn)染病毒梯度的增加而逐漸升高，表明該慢病毒有良好的感染活性，并計(jì)算病毒滴度為：1.4×10⁸ TU/mL。
 

CD19抗原慢病毒滴度檢測(cè)結(jié)果
 

• CD19-293T穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株構(gòu)建

使用上述CD19抗原慢病毒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，經(jīng)過多輪篩選，得到CD19抗原高度均一表達(dá)的CD19-293T穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞。
 

CD19-293T細(xì)胞CD19抗原陽性率檢測(cè)結(jié)果
 

• FMC63 CAR慢病毒滴度檢測(cè)

我們?cè)O(shè)計(jì)了如下結(jié)構(gòu)的靶向CD19抗原的FMC63 CAR分子，并將其構(gòu)建慢病毒載體上，進(jìn)行慢病毒制備。采用上述方法檢測(cè)FMC63 CAR慢病毒滴度，病毒滴度約為：4.33×10⁸ TU/mL。
 

FMC63 CAR分子結(jié)構(gòu)
 

FMC63 CAR慢病毒滴度檢測(cè)結(jié)果