近日，在美國FDA召開的專家咨詢會(huì)議中，針對Sarepta Therapeutics和羅氏（Roche）聯(lián)合開發(fā)的SRP-9001這一基因療法，F(xiàn)DA細(xì)胞、組織和基因治療咨詢委員會(huì)（CTGTAC）以8:6的微弱投票優(yōu)勢對其通過加速審批通道上市予以支持。作為一款特異性靶向治療杜氏肌營養(yǎng)不良癥（DMD）的新型療法，SRP-9001通過AAV遞送編碼基因，促使微肌營養(yǎng)不良蛋白增加以改善患者的肌肉功能。
 

盡管SRP-9001已獲得委員會(huì)的支持，但最終審查結(jié)果猶未可知。FDA可能存在的顧慮在哪里？其安全性和有效性到底能否得到認(rèn)可？

這里我們從臨床前研究的角度出發(fā)，圍繞以下幾個(gè)要點(diǎn)，一起走近DMD基因治療及其相關(guān)疾病模型：
1.關(guān)于杜氏肌營養(yǎng)不良癥
2.代表性基因療法及相關(guān)模型：AAV補(bǔ)充mini基因、ASO跳躍外顯子、CRISPR基因編輯
3.針對疾病模型短板可采用怎樣的創(chuàng)新策略
 

關(guān)于杜氏肌營養(yǎng)不良癥

杜氏肌營養(yǎng)不良癥是由DMD突變導(dǎo)致的抗肌萎縮蛋白功能異常，最終造成肌肉進(jìn)行性壞死的X染色體隱性遺傳性罕見病。其發(fā)病率約為36/10萬，中國約有6-10萬患者，屬于罕見病中的常見病，是全球最常見的肌營養(yǎng)不良類型。
 

DMD代表性基因療法及相關(guān)模型

DMD的基因治療主要分為三個(gè)類型：通過AAV補(bǔ)充mini dystrophin或micro-dystrophin；ASO跳躍外顯子療法；CRISPR基因編輯。

通過AAV補(bǔ)充mini dystrophin或micro-dystrophin
如果能起到作用的話，這種療法所適用的患者范圍有可能是最廣的，因?yàn)檠a(bǔ)充療法對不同突變情況的患者都可能起作用。Sarepta、Roche、Solid等公司正在布局這類AAV遞送mini dystrophin或micro-dystrophin療法，其中屬SRP-9001進(jìn)展最快。

該管線的臨床前動(dòng)物實(shí)驗(yàn)用到的是DMD疾病研究經(jīng)典模型mdx^[1]，mdx小鼠23號(hào)外顯子的CAA密碼子突變?yōu)門AA終止密碼子進(jìn)而導(dǎo)致基因表達(dá)異常。mdx小鼠雖然出現(xiàn)了DMD的疾病表型，但相對于患者的實(shí)際情況來說：
（1）mdx小鼠表型更輕微，特別是在纖維肌溶解、肌肉萎縮方面；
（2）mdx小鼠的壽命大概是正常小鼠的80%，而DMD患者的壽命平均只有健康人群的1/3；
（3）mdx小鼠突變位點(diǎn)在E23，并非熱點(diǎn)突變位置，不太符合疾病同源性。

另外，mdx小鼠的不同背景表型還存在有些許不同的情況，這使得在mdx小鼠上進(jìn)行研究需要考慮更多因素。
 

ASO跳躍外顯子療法

作為DMD相關(guān)基因治療管線中數(shù)量最多的一種，ASO跳躍外顯子療法得益于ASO的靶向性強(qiáng)、易于合成等優(yōu)勢，Sarepta、Nippon、DYNE等藥企都有所布局，靶向跳躍的外顯子有44、45、50、51、53等，且文獻(xiàn)中也出現(xiàn)多個(gè)外顯子跳躍療法。

Nippon的管線NS-065/NCNP-01通過ASO靶向跳躍外顯子53，臨床前動(dòng)物實(shí)驗(yàn)使用了mdx52小鼠^[2]，該小鼠Dmd基因的52號(hào)外顯子缺失，導(dǎo)致在E53上終止翻譯。mdx52小鼠相對于mdx小鼠來說，雖然突變位點(diǎn)更接近于患者的熱點(diǎn)突變位置，更適合ASO基因治療，但在鼠源Dmd基因上篩選用于靶向人DMD基因的特異性ASO是存在一定風(fēng)險(xiǎn)的，因?yàn)槿撕托∈笾�間存在一定的DMD基因序列差異。

而mdx小鼠非常不適合用于ASO跳躍療法，特別是ASO藥物特異性跳躍23號(hào)之后的外顯子的情況下，因?yàn)閙dx小鼠在E23上已經(jīng)有終止子，而跳躍其后的外顯子無法帶來行為學(xué)方面的藥效反應(yīng)，僅通過mRNA表達(dá)水平來評估藥效是匱乏的。

有的文獻(xiàn)還使用了hDMDΔ52/mdx模型檢測ASO跳躍療法的藥效^[3]，該模型是通過TG轉(zhuǎn)入人全長DMD并敲除E52導(dǎo)致閱讀框破壞，然后與mdx小鼠進(jìn)行雜交而構(gòu)建的。hDMDΔ52/mdx模型雖然具有人DMD全長蛋白，但其DMD基因插入位置未知，不是X染色體，且需要進(jìn)一步與mdx小鼠雜交，模型構(gòu)建比較復(fù)雜。
 

CRISPR基因編輯療法

該療法在DMD疾病上的進(jìn)展比較緩慢，其中一個(gè)原因是由于缺乏可以滿足特異性藥物靶點(diǎn)篩選及藥物預(yù)見性的DMD疾病模型。CRD-TMH-001是第一個(gè)基于CRISPR治療DMD的管線，目前已獲批IND。

在文獻(xiàn)中也出現(xiàn)不少CRISPR治療DMD的成功案例，如通過CBE胞嘧啶編輯器去除終止子，使得Dmd基因可以繼續(xù)翻譯，該實(shí)驗(yàn)使用了Δ50;h51KI模型^[4]。該模型是將小鼠Dmd的E51進(jìn)行人源化，敲除E50并在E51上引入終止子。相對于mdx52，CRISPR編輯療法使用的模型Δ50;h51KI對藥物靶向序列的人源化要求程度更高，這也是CRISPR基因編輯療法所必須要考慮的重要因素，因?yàn)槊摪薪o患者帶來的負(fù)面影響是不可估量的。但同時(shí)，與hDMDΔ52/mdx相比，Δ50;h51KI模型具有人源化區(qū)域不足的缺點(diǎn)。
 

強(qiáng)勢破局的人源化小鼠

鑒于DMD基因的突變特點(diǎn)及現(xiàn)有模型的缺點(diǎn)，如構(gòu)建復(fù)雜、Tg導(dǎo)致基因插入位點(diǎn)不確定、人源化區(qū)域不足和突變非熱點(diǎn)突變等問題，賽業(yè)生物自主研發(fā)了DMD疾病模型，除了經(jīng)典模型mdx小鼠，還有DMD(hE8-30)、DMD(hE44-45)、DMD(hE49-53)等DMD熱點(diǎn)突變區(qū)域人源化小鼠。另外，我們可以通過在野生型人源化小鼠的基礎(chǔ)上進(jìn)行基因再修飾，進(jìn)一步構(gòu)建熱點(diǎn)突變?nèi)嗽椿�疾病模型，為研究提供更理想的對照組和實(shí)驗(yàn)組。

賽業(yè)生物hDMD小鼠特點(diǎn)：

● 擁有熱點(diǎn)突變區(qū)域的野生型及在此基礎(chǔ)上構(gòu)建的點(diǎn)突變?nèi)嗽椿�疾病模�?/strong>；

● 可以直接在已有的野生型人源化基礎(chǔ)上定制不同的點(diǎn)突變，提高效率及成功率；

● 人源化區(qū)域包括大部分藥物靶向區(qū)域，更適合可用于藥物篩選及藥效研究，特別是ASO、CRISPR、siRNA等基因治療相關(guān)藥物；

●人DMD基因原位插入，拷貝數(shù)確定，可穩(wěn)定遺傳。

HUGO-GT^TM全基因組人源化模型構(gòu)建計(jì)劃

不僅是DMD，針對視網(wǎng)膜色素變性（RP）、黃斑變性（AMD）、帕金森�。≒D）等多種疾病類型，如果要深入研究其致病機(jī)理，長片段甚至全基因組人源化小鼠是更好的選擇。但全基因組替換所需的技術(shù)難度高，大規(guī)模引入的外源序列可能會(huì)影響原本基因的表達(dá)調(diào)控。

為此，賽業(yè)生物啟動(dòng)了HUGO-GT^TM計(jì)劃，基于自主研發(fā)的TurboKnockout-Pro技術(shù)，對鼠源基因?qū)崿F(xiàn)原位替換，成功構(gòu)建了涵蓋更豐富干預(yù)靶點(diǎn)的全基因組人源化小鼠。HUGO-GT^TM小鼠搭載了更高效的大片段載體融合技術(shù)，可以作為萬能模板進(jìn)行針對性的突變定制服務(wù)，是更貼近真實(shí)世界生物機(jī)制的藥物臨床前研究模型。
 

參考文獻(xiàn)：

[1] Ryder-Cook AS, Sicinski P, Thomas K, et al. Localization of the mdx mutation within the mouse dystrophin gene. [J]. EMBO,1988.

[2] Mizobe Y , Miyatake S , Takizawa H , et al. In Vivo Evaluation of Single-Exon and Multiexon Skipping in mdx52 Mice[J].Methods Mol Biol, 2018.

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[4]Zhang Y, Li H, Nishiyama T, McAnally JR , et al. A humanized knockin mouse model of Duchenne muscular dystrophy and its correction by CRISPR-Cas9 therapeutic gene editing[J]. Mol Ther Nucleic Acids. 2022.