P2rx7基因是ATP能量代謝通路中的關(guān)鍵基因。該基因編碼上皮細(xì)胞和免疫效應(yīng)細(xì)胞外的ATP門控陽離子通道，能夠影響機(jī)體免疫系統(tǒng)的調(diào)控，影響炎癥發(fā)生與癌癥發(fā)展，是身體免疫調(diào)節(jié)的關(guān)鍵基因之一。P2rx7也參與各種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)病機(jī)制的調(diào)控，P2rx7基因編輯模型目前已應(yīng)用于結(jié)腸炎相關(guān)癌癥與神經(jīng)系統(tǒng)的研究等等。

賽業(yè)生物《每周一鼠》，每周五更新，為大家講解一個(gè)小鼠模型的故事，希望對大家了解不同的小鼠模型有所幫助。今天和大家見面的是P2rx7基因編輯小鼠。

P2rx7基因簡介
P2rx7基因，又稱P2X7R、P2X（7），位于小鼠的5號染色體上，該基因在ATP能量代謝過程中起著至關(guān)重要的作用。它是一種在上皮細(xì)胞和免疫效應(yīng)細(xì)胞上表達(dá)的細(xì)胞外ATP門控陽離子通道^[1]，能夠影響T調(diào)節(jié)細(xì)胞功能^[2]、促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生、細(xì)胞死亡的調(diào)節(jié)、感染性病原體的消除等等。并且ATP-P2X7R通路在自身免疫性疾病和炎癥性腸病等慢性炎癥性疾病中扮演著重要角色^[3]。

P2rx7編碼的蛋白能夠?qū)崿F(xiàn)多種功能，包括ATP結(jié)合活性、細(xì)胞外ATP門控陽離子通道活性、與脂多糖結(jié)合活性、參與細(xì)胞體積的負(fù)性調(diào)節(jié)和對疼痛的感覺感知等等。并且參與調(diào)控包括有機(jī)磷酸酯運(yùn)輸在內(nèi)的多個(gè)過程的上游或內(nèi)部、細(xì)胞因子產(chǎn)生的正調(diào)控和分泌的正向調(diào)節(jié)。該蛋白位于幾個(gè)細(xì)胞組成部分，包括質(zhì)膜外側(cè)、神經(jīng)肌肉接頭和神經(jīng)元細(xì)胞體，是質(zhì)膜的重要組成部分。其在生物體大腦、心臟和腎臟中有明顯表達(dá)。
 

圖1 P2rx7基因相關(guān)信息
來源：RDDC罕見病數(shù)據(jù)中心

（https://rddc.tsinghua-gd.org/details/gene?gene=GD4ALG）

P2rx7基因編輯小鼠模型
1.結(jié)腸炎相關(guān)癌癥
結(jié)腸炎相關(guān)癌癥（CAC）是炎癥性腸�。↖BD）的并發(fā)癥。胞外ATP與嘌呤能受體P2RX7的結(jié)合是控制腸道炎癥的關(guān)鍵因素，起到限制促炎肥大細(xì)胞和細(xì)胞因子升高并促進(jìn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）和腸神經(jīng)元存活的作用。研究者研究了P2RX7阻斷在已建立的CAC小鼠模型中的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雖然P2RX7介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，但它也能在早期起到抑制CAC發(fā)展的作用。P2RX7阻斷增強(qiáng)了腸上皮細(xì)胞的增殖并保護(hù)其免于凋亡。P2RX7阻斷的增殖作用與刺激腸上皮細(xì)胞增殖的TGFβ1升高有關(guān)。最后，P2RX7阻斷還改變了免疫細(xì)胞浸潤，并促進(jìn)了Treg在消化系統(tǒng)病變內(nèi)的積累。

圖2 P2rx7基因的敲除方案策略^[4]

（簡稱如下：B,BamHI；RV，EcoRV；K，KpnI；S，SalI）
 

研究者首先通過ES打靶技術(shù)將Neo篩選元件插入到P2rx7基因的一個(gè)外顯子中，破壞了羧基端編碼區(qū)，建立P2rx7基因敲除小鼠。再通過化學(xué)藥物誘導(dǎo)的方式構(gòu)建結(jié)腸炎相關(guān)癌癥模型^[5]。模型建立成功后，使用硫酸葡聚糖（DSS）進(jìn)行治療，與對照組相比，P2rx7^-/-小鼠從炎癥病變中恢復(fù)得更快，P2RX7的遺傳和藥理學(xué)失活都抑制了DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎癥。
 

圖3 結(jié)腸組織的HE染色和炎癥評分^[5]
 

后續(xù)為了研究P2RX7對炎癥誘導(dǎo)的結(jié)腸直腸癌的影響，偶氮甲烷誘導(dǎo)的小鼠接受了三個(gè)周期的DSS以模擬慢性結(jié)腸炎。治療結(jié)束后，P2rx7^-/-小鼠顯示出更高的疾病活動(dòng)評分，并且與WT小鼠（每只小鼠平均2個(gè)息肉）相比，小鼠出現(xiàn)明顯更多的肉眼息肉（每只小鼠平均9個(gè)息肉）。正如對CAC模型所預(yù)期的那樣，在WT小鼠中腫瘤位于結(jié)腸的遠(yuǎn)端，而在P2rx7^-/-小鼠中它們侵入到結(jié)腸的內(nèi)側(cè)部分。這些結(jié)果表明P2RX7功能的改變促進(jìn)了腫瘤的進(jìn)展。
 

圖4 P2RX7活性對腫瘤組織發(fā)展的影響^[5]
 

以上結(jié)果表明，P2RX7失活會(huì)抑制炎癥，但同時(shí)會(huì)增強(qiáng)腫瘤易感性�？傊�，研究結(jié)果揭示了P2RX7在預(yù)防CAC中的意外作用，提示在使用P2RX7抑制劑治療IBD時(shí)要謹(jǐn)慎，因?yàn)榭赡軙?huì)增加CAC的風(fēng)險(xiǎn)。

2.神經(jīng)系統(tǒng)
P2RX7通道參與各種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病機(jī)制。越來越多的研究表明，它存在于神經(jīng)元中，但其具體表達(dá)部分和功能一直存在爭議。為了解決這一問題，研究者構(gòu)建了P2RX7 BAC轉(zhuǎn)基因小鼠，并在體內(nèi)可視化功能性EGFP標(biāo)記的P2RX7受體。對小鼠模型的廣泛表征揭示了顯性P2RX7-EGFP蛋白在小膠質(zhì)細(xì)胞、伯格曼膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)，但在神經(jīng)元細(xì)胞中沒有表達(dá)。
 

圖5 P2RX7基因的轉(zhuǎn)基因載體構(gòu)建流程圖^[6]

研究人員為了確定P2RX7在大腦中定位的總體模式，對所有小鼠系的腦切片進(jìn)行了3，3'-二氨基聯(lián)苯胺（DAB）染色，如圖6。結(jié)果顯示在小腦皮層的分子層中發(fā)現(xiàn)了特別高的P2RX7-EGFP密度（圖6A）。此外，在齒狀回（DG）、大腦皮層和嗅球以及丘腦、下丘腦、黑質(zhì)和腹腦橋的分子層中檢測到強(qiáng)熒光標(biāo)記。不同大腦區(qū)域顯示出相似的蛋白質(zhì)比例和組織特異性強(qiáng)度（圖6B），表明轉(zhuǎn)基因的表達(dá)反映了內(nèi)源性P2RX7的表達(dá)模式和表達(dá)水平，從而暗示控制P2RX7表達(dá)的重要調(diào)節(jié)元件在所選的BAC構(gòu)建體中得以保留和功能。除了伯格曼膠質(zhì)細(xì)胞（圖6C）外，P2RX7還存在于小腦的小膠質(zhì)細(xì)胞中。
 

圖6 轉(zhuǎn)基因P2RX7-EGFP的分布格局^[6]

A,腦部抗GFP抗體的DAB染色；B,不同大腦區(qū)域中轉(zhuǎn)基因和內(nèi)源性P2RX7蛋白的比例;C,小腦與抗GFP和S100β抗體共同標(biāo)記,可見橈側(cè)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的典型染色模式。

研究者后續(xù)使用細(xì)胞類型特異性標(biāo)記物（圖7A–F）和海馬體CA1區(qū)域中GFP陽性細(xì)胞的定量（圖7G）證明P2RX7-EGFP主要在小膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)（占所有Iba1陽性細(xì)胞的93%），而其余GFP陽性細(xì)胞中的大多數(shù)屬于少突膠質(zhì)細(xì)胞譜系并共表達(dá)Olig2（如圖7）。
 

圖7 P2RX7-EGFP在CA1區(qū)域中表達(dá)細(xì)胞類型的同一性和數(shù)量^[6]

A-F,轉(zhuǎn)基因小鼠腦切片與抗GFP抗體、針對指示標(biāo)記蛋白與S100β（S2532，西格瑪奧德里奇）的抗體。圖中顯示了海馬CA1區(qū)域；G,流式細(xì)胞分析

綜上所述，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，P2RX7主要位于小膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞中，并且少量位于大腦中的S100β陽性細(xì)胞以及小腦中的伯格曼膠質(zhì)細(xì)胞中。鑒于生理學(xué)上的這種分布，以及在神經(jīng)組織損傷或癲癇持續(xù)狀態(tài)后沒有觀察到神經(jīng)元中P2RX7蛋白的上調(diào)，可以得出，報(bào)告的P2RX7依賴性神經(jīng)元損傷是小膠質(zhì)細(xì)胞激活的明顯表現(xiàn)的結(jié)果，而不是神經(jīng)元P2RX7受體的直接激活。

總結(jié)
P2rx7基因作為ATP能量代謝通路中的關(guān)鍵基因，能夠影響機(jī)體免疫系統(tǒng)的調(diào)控，影響炎癥發(fā)生與癌癥發(fā)展，并且參與神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病機(jī)制調(diào)節(jié)。P2rx7基因編輯模型可以用于結(jié)腸炎相關(guān)癌癥與神經(jīng)系統(tǒng)等領(lǐng)域的研究，P2RX7失活會(huì)抑制炎癥，但同時(shí)會(huì)增強(qiáng)腫瘤易感性；在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中主要表達(dá)于小膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞中，并且少量存在于大腦中的S100β陽性細(xì)胞以及小腦中的伯格曼膠質(zhì)細(xì)胞中。P2rx7基因編輯模型為結(jié)腸炎相關(guān)癌癥的研究以及P2rx7在腦組織中的定位研究和神經(jīng)疾病的發(fā)病機(jī)制研究提供了平臺，具有廣泛的科研意義。
 

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P2rx7基因敲除小鼠

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品系名稱：

C57BL/6N-P2rx7^em1Cya

品系編號：

KOCMP-18439-P2rx7-B6N-VA

產(chǎn)品編號：

S-KO-03540

應(yīng)用方向：

❖ 發(fā)育生物學(xué)；免疫系統(tǒng)

❖ 皮膚；信號轉(zhuǎn)導(dǎo)

❖ 骨骼系統(tǒng)；視力系統(tǒng)

打靶方案：

P2rx7基因敲除小鼠打靶方案示意圖

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參考文獻(xiàn)：
[1]Cai X, Yao Y, Teng F, Li Y, Wu L, Yan W, Lin N. The role of P2X7 receptor in infection and metabolism: Based on inflammation and immunity. Int Immunopharmacol.2021 Dec;101(Pt A):108297. doi: 10.1016/j.intimp.2021.108297. Epub 2021 Oct 29. PMID: 34717202.

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