專注于應用基因編輯小鼠模型，探討基因與心臟功能影響作用的基礎研究，賽業(yè)生物首席科學家俞曉峰博士最近對首都醫(yī)科大學羅大力教授進行了特邀訪談，請羅教授基于她最近在此研究領域發(fā)表的相關成果，從提出研究項目相關假設，選擇候選基因及建立相關基因編輯小鼠疾病模型，到解析相關基因與心臟疾病致病作用機制等方面進行深入解讀，以幫助我們更好了解與學習模式動物基礎研究中的經典思路與策略，為今后基因功能相關的模式動物基礎研究工作，提供有價值及實際應用的參考意義。

本專訪是基于羅老師最近在發(fā)表在Circulation和Cell Death & Differentiation期刊上的相關文章為基礎，拋磚引玉出相關問題，以求共同探討交流與學習。

俞曉峰博士：根據(jù)集鈣蛋白（Casq1）基因不同組織表達特征，該基因在人體骨骼肌中表達量較高，而在心臟組織轉錄水平很低，蛋白表達未見報道，羅老師為什么會選擇將該基因敲除在心臟組織特異性敲除的策略，評價基因缺失對心臟功能的影響作用？

羅大力教授：首先感謝賽業(yè)生物為我們構建了高效精準的基因模式動物，使我們能夠從動物整體水平系統(tǒng)研究關鍵蛋白的功能。

集鈣蛋白是肌漿網鈣貯存蛋白，使肌細胞在興奮時有效釋放出游離的鈣離子進入胞漿，產生肌肉收縮。已發(fā)現(xiàn)二種集鈣蛋白亞型，1型和2型（Casq1和Casq2）。哺乳動物的Casq1主要表達在骨骼肌，而Casq2只表達在心肌，二者均與人類遺傳疾病密切相關。Casq1缺失可引起骨骼肌損傷和高熱，即惡性高熱�。∕H），Casq2缺失可致兒茶酚胺多形性室性心律失常（CPVT）。有趣的是在已報道的大量MH患者中除骨骼肌癥狀外，也發(fā)生心動過速和室性心律失常，但病生理的機理并不清楚。我們在前期研究糖尿病心肌病時偶然發(fā)現(xiàn)動物心臟除表達Casq2外，也表達Casq1亞型。因此，令我們想到MH的心臟問題是否與這個心臟表達的Casq1有關？心肌細胞的結果使我們有信心進一步構建了心臟特異性Casq1敲除鼠進行系統(tǒng)性Casq1在心臟的功能和病理意義的研究。

俞曉峰博士：羅老師應用我們構建的Casq1條件性打靶（floxed）小鼠模型，不僅用該floxed小鼠與心臟特異性表達Cre小鼠交配繁殖，以研究Casq1基因在心臟組織敲除后對心臟功能損傷的影響及其作用機制。同時，還用該floxed小鼠與全身表達Cre小鼠交配繁殖，實現(xiàn)全身敲除Casq1基因的目的，通過對不同敲除策略小鼠模型的比較研究，羅老師能否分享一下從中獲得了哪些不一樣的發(fā)現(xiàn)或意外收獲？

羅大力教授：我們認為做基礎研究最重要的使命是解決臨床中發(fā)現(xiàn)的問題，為臨床未知的疾病或疾病發(fā)生的病生理機制提供理論基礎和有效的治療思路和策略�；颊甙l(fā)生基因遺傳性疾病是影響全身該基因相關蛋白的表達進而發(fā)揮功能。因此，構建心臟條件性基因模式動物以排除骨骼肌Casq1改變的影響同時，再制備全身性Casq1敲除鼠模擬人類的病理狀態(tài)對解決相關疾病的病生理機制具有重要的支持作用。

有意義的是全身和心臟條件性Casq1基因敲除鼠在心臟的疾病表型完全相似，甚至心臟條件性敲除鼠的心律失常癥狀更為嚴重，說明MH的心臟癥狀與骨骼肌損傷無關（目前認為MH心動過速和室性心律失常與骨骼肌損傷釋放的大量酸性產物，炎性因子和自由基有關），而是由于心臟的Casq1蛋白表達減少直接造成的。

俞曉峰博士：我們注意到，羅老師在研究中通過應用藥物（比如2% 異弗烷麻醉劑），或41℃高溫來誘導Casq1敲除小鼠模型，構建相應的小鼠疾病模型，研究該基因對心臟功能的影響作用。是不是可以理解為，如果沒有這些誘導因素的參與，只是Casq1基因的敲除，很難觀察到明顯表型改變？能否分享一下你們如此設計實驗的想法與依據(jù)？

羅大力教授：臨床患者發(fā)生MH或CPVT都是在特定條件下；MH經常是在氣體麻藥使用中或高溫環(huán)境，或劇烈的運動條件下發(fā)生，CPVT是在激烈運動條件下發(fā)生。因此，我們模擬臨床癥狀誘導環(huán)境（麻藥或高熱）產生完全相似的表型，說明Casq1在MH發(fā)生中的關鍵作用。作為基礎研究工作者，更重要的是回答和解決為什么通常情況下沒有癥狀，需在這些誘導因素存在的條件下發(fā)生致命性心律失常，由于突然發(fā)生而不能快速而有效救治，其死亡率高達90%。通過研究我們發(fā)現(xiàn)在2種Casq1敲除鼠，Casq1蛋白的多聚體表達輕度減少，而單體，二聚體/三聚體下調非常明顯。在麻藥和高溫條件下Casq1多聚體解聚成單體/二聚體/三聚體，最終使Casq1整體水平更加減少是MH心臟表型的病理生理基礎。說明Casq1生理功能主要是通過多聚體與蘭尼定受體（Ryanodine receptor）結合，抑制其活性，減少鈣庫動員。在MH誘因條件下，對正常人多聚體的減少不足以產生疾病表型，而Casq1發(fā)生變異時，Casq1的減少凸顯，或蘭尼定變異時，誘因的存在使Casq1的減少不足以抑制已改變的蘭尼定受體，進而發(fā)生異常鈣釋放和心律失常。以上結果說明心臟Casq1改變與臨床疾病表型高度吻合，因此，解決了MH發(fā)生的室性心律失常的病生理機制以及解救藥丹曲洛林發(fā)揮治療作用的理論基礎。當然，這些研究也提出一些有趣的問題需要進一步研究和闡釋，比如為什么Casq1多聚體在生理條件下難以有效完全敲除等，我們也就此類問題曾經通話討論過，認為這可能與研究所用的心臟特異性Cre小鼠本身特性等相關因素有關。

此外，我們在這二種基因鼠中還發(fā)現(xiàn)其他心臟的表型，即在不需要誘導因素存在的基礎情況下表現(xiàn)出明顯的心臟病理性改變，這些表型的發(fā)生也與Casq1多聚體的多少有關。這是我們以后進一步重點研究的內容。

俞曉峰博士：縫隙連接蛋白Cx43磷酸化修飾有利于心臟發(fā)揮其正常功能，而相應的去磷酸化修飾則可引起心肌細胞死亡與心律失常等破壞反應，在已報道的Cx43基因約10個去磷酸化位點中，羅老師為什么會選擇pS282A位點進行深入研究？

羅大力教授：縫隙連接蛋白Cx43構成的縫隙通道是心肌非常重要的細胞間通訊工具，在多種心臟疾病中，Cx43發(fā)生重構，進而參與心肌細胞電紊亂致心律失常和心肌病理性損傷。生理情況下，Cx43磷酸化是極為重要的調節(jié)Cx43通道功能，以及心肌細胞穩(wěn)態(tài)翻譯后修飾形式。在心肌缺血，肥大，心衰和電異�；颊吆湍Ｐ蛣游镄呐K中發(fā)現(xiàn)Cx43去磷酸化與心肌病理改變密切相關，但具體直接介導心肌損傷的下調磷酸化位點不清。十幾年前偶然間發(fā)現(xiàn)一個藥物可以引起心肌細胞電活動不一致，并進一步發(fā)現(xiàn)該藥物可使Cx43絲氨酸282位點磷酸化下調，進一步在藥物作用的心肌細胞培養(yǎng)48小時后竟然導致部分死亡。由此推斷Cx43-S282位點磷酸化是心肌細胞電和生存穩(wěn)態(tài)的關鍵調節(jié)靶點。

俞曉峰博士：縫隙連接蛋白Cx43基因全身敲除會導致胚胎發(fā)育障礙，敲除純合小鼠出生后很快死亡。我們應用ES打靶技術構建的Cx43點突變（S282A）小鼠，也難以獲得純合點突變小鼠，且雜合S282A突變小鼠，也有約30%小鼠出生后20天內死亡，而其他雜合突變小鼠都會自發(fā)出現(xiàn)不同程度的心律失常等表型，這是非常有意思發(fā)現(xiàn)，羅老師對于這種基因突變位點相同，且表現(xiàn)不同程度的表型改變現(xiàn)象，應該如何解釋或可能性推測嗎？

羅大力教授：心臟中縫隙連接蛋白Cx43具有重要的多重功能，它主要功能是介導細胞間通訊，但大量的研究發(fā)現(xiàn)它在細胞穩(wěn)態(tài)，線粒體功能和組織發(fā)生及發(fā)育中等具有極其重要的調節(jié)作用。心肌缺血性損傷、心衰時心功下降和結構的改變以及心律失常等都與Cx43的功能及其結構改變密切相關。Cx43-S282單一磷酸位點突變?yōu)楸�氨酸，即不能被磷酸化，呈現(xiàn)出無純合子代，雜合子代有典型的心肌細胞凋亡和動物死亡，以及生存下來的動物帶有持續(xù)一生的心律失常。迄今對十幾種Cx43磷酸化位點的研究報道還未見發(fā)生如此重要的功能作用，說明這個位點對于Cx43蛋白功能的維系極其重要，是關鍵分子。我們進一步的研究發(fā)現(xiàn)，那些發(fā)生心肌細胞凋亡的雜合動物S282磷酸化水平是最低的（下降>50%），心律失常最重的，幾乎也是100%發(fā)生死亡的動物。而存活下來的動物磷酸化下降約30%左右，只表現(xiàn)出心肌的縫隙通道傳導障礙和各種心律失常，包括室性心律失常。因此，這個位點的磷酸化水平改變呈現(xiàn)層級遞階的表型，當然其背后的信號傳導機制是不同的。這些都充分體現(xiàn)了Cx43在心肌電和生存穩(wěn)態(tài)的調節(jié)作用，而S282位點極可能是發(fā)揮其調節(jié)作用的關鍵靶點，或關鍵靶點之一。

俞曉峰博士：通過手術操作，在動物體內建立缺血再灌注動物疾病模型，已成為心臟損傷相關研究的傳統(tǒng)常用方法，而如何將獲得的動物實驗結果與臨床相關患者實際情況聯(lián)系起來，也將顯得很有意義，比如臨床上心律失�；蛐募」Ｈ�患者人群中，是否也存在Cx43基因pS282A位點突變及其相關性如何？

羅大力教授：這是一個非常好的問題。既然Cx43-S282位點極可能是發(fā)揮Cx43調節(jié)作用的關鍵靶點，或關鍵靶點之一，也參與了動物的缺血再灌注損傷和心律失常的發(fā)生。那么，在人類疾病中是否有它改變的蹤跡呢？這是我們下一步重點要研究的內容。目前在收集病人的心臟樣本，但尋找相對正常的對照病人的樣本非常難，如果能夠找到愿意合作的單位和研究人員就更好。

俞曉峰博士：由于Casq1基因缺失或Cx43基因S282位點的去磷酸化修飾，都會不同程度影響到心臟正常功能作用，未來是否有可能應用基因編輯方法，比如替代相關野生基因或修正突變基因等基因療法，達到緩解或治療心臟相關疾病的作用？

羅大力教授：這又是一個非常好的轉化問題。我們的研究發(fā)現(xiàn)Cx43-S282位點磷酸化狀態(tài)在細胞穩(wěn)態(tài)維系中極其重要，這里不僅僅是其磷酸化下調與該調節(jié)作用有關，如果超過正常2倍的磷酸化上調也是極其危險信號，會出現(xiàn)另一種形式的細胞凋亡和電紊亂。因此，在未來可能的治療策略中我們考慮應以化藥為首選，這主要是化藥的劑量可控及作用時間短。目前我們也在這方面做嘗試。

專家簡介

羅大力，首都醫(yī)科大學藥理學系教授，博士生導師

哈爾濱醫(yī)科大學藥理學碩士和生理學博士畢業(yè)，北京大學心血管研究所病理生理學博士后。曾在日本新瀉大學和美國國立衛(wèi)生研究院學習和合作研究。研究方向是心血管藥理學：主要從事心臟和血管相關疾病的病生理學，和藥物作用及其作用機制研究，尤其是心衰，心律失常和心肌梗死發(fā)生和發(fā)展的重要信號轉導機制，以探尋新的藥物靶點并進行潛在新藥研發(fā)。主持國家自然科學基金項目8項和省部級各類項目9項。獲省部級科學技術獎7項。在國內外雜志發(fā)表80余篇學術論文，SCI收錄第一和責任作者60余篇。

俞曉峰，賽業(yè)生物中國區(qū)副總裁兼首席科學家

軍事醫(yī)學科學院博士，國際知名模式動物和細胞生物學專家，耶魯大學醫(yī)學院和紐約大學醫(yī)學院研究員，美國基因打靶公司（iTL）和應用干細胞公司（ASC）資深科學家。在基因修飾模式動物領域有超過20多年研發(fā)與管理等方面的豐富經驗，在干細胞相關領域及哺乳動物細胞系基因改造研究也取得了巨大成就，其研究成果多次發(fā)表在Nat Immunol、Hum Mol Genet、Mol Cell Biol等高水平雜志上。

相關文獻

1. Functional calsequestrin-1 is expressed in the heart and its deficiency is causally related to malignant hyperthermia-like arrhythmia. Circulation, 2021

2. Connexin 43 dephosphorylation at serine 282 is associated with connexin43-mediated cardiomyocyte apoptosis. Cell Death & Differentiation, 2019

3. Connexin 43 dephosphorylation contributes to arrhythmias and cardiomyocyte apoptosis in ischemia/reperfusion hearts. Cell Death & Differentiation, 2019