在生物醫(yī)學(xué)研究中，低背景成像是至關(guān)重要的。熒光成像不可避免地會(huì)出現(xiàn)光漂白和相對(duì)較高的自發(fā)熒光背景。近年來(lái)，余輝發(fā)光（afterglow luminescence）吸引了人們的注意力。余輝發(fā)光材料存儲(chǔ)了輻照的光能，在激發(fā)光停止后仍能持續(xù)發(fā)光。古代的夜光杯、夜明珠等便是由這種材料制成。

余輝發(fā)光能夠避開(kāi)熒光成像的缺點(diǎn)，在體內(nèi)無(wú)背景成像中具有廣闊的應(yīng)用前景，有望成為活體成像的替代方案，應(yīng)用于細(xì)胞追蹤、癌癥成像、血管可視化等。不過(guò)，現(xiàn)有余輝材料存在結(jié)構(gòu)惰性，響應(yīng)位點(diǎn)不足，這使得可激活余輝探針的設(shè)計(jì)變得相當(dāng)困難。同時(shí)，余輝強(qiáng)度的衰減也影響人們準(zhǔn)確定量分析物。

為此，湖南大學(xué)譚蔚泓院士、張曉兵教授、宋國(guó)勝教授領(lǐng)導(dǎo)的研究團(tuán)隊(duì)提出一種比率余輝發(fā)光納米平臺(tái)，可用于定制各種可激活的余輝探針，并對(duì)特定分析物進(jìn)行可靠的定量和分子成像。這項(xiàng)研究成果發(fā)表在《Nature Communications》雜志上。
 

研究材料和方法
在這項(xiàng)研究中，體外實(shí)驗(yàn)使用了4T1和RAW264.7巨噬細(xì)胞，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)則使用了Nos2^−/−小鼠和野生型小鼠（這兩種小鼠均購(gòu)自賽業(yè)生物）。研究人員在制備出RAN1、RAN2和RAN3探針后，測(cè)定了熒光和余輝成像。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，他們使用了流式細(xì)胞分析、免疫熒光分析、細(xì)胞凋亡分析等。

技術(shù)路線
01比率余輝發(fā)光納米平臺(tái)的設(shè)計(jì)
02三種比率余輝探針的制備，分別響應(yīng)NO、ONOO⁻和pH
03從多方面評(píng)估比率余輝探針的性能
04利用比率余輝探針進(jìn)行活體成像
05利用比率余輝探針來(lái)評(píng)估巨噬細(xì)胞極化

研究結(jié)果
1.比率余輝發(fā)光納米平臺(tái)的設(shè)計(jì)
研究人員提出了一種基于余輝的能量轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，稱(chēng)為“余輝共振能量轉(zhuǎn)移”（ARET），它融合了FRET和余輝發(fā)光的優(yōu)點(diǎn)。在ARET中，F(xiàn)RET的供體熒光團(tuán)被余輝底物取代。在激光輻照后，余輝底物產(chǎn)生激發(fā)態(tài)中間體來(lái)存儲(chǔ)能量，之后能量被轉(zhuǎn)移到能量受體，在輻照停止后發(fā)出另一道余輝。因此，可通過(guò)兩次發(fā)光的自校準(zhǔn)來(lái)實(shí)現(xiàn)比率余輝成像，有效解決余輝衰減帶來(lái)的問(wèn)題。

基于這種ARET策略，作者隨后設(shè)計(jì)出一種通用的比率式余輝納米平臺(tái)（RAN）。它通過(guò)自組裝策略整合響應(yīng)分子（NRM、ORM或PRM）、余輝底物（MEHPPV）、表面活性劑（F127）和余輝引發(fā)劑（TPP或BDP）來(lái)定制可激活的余輝探針，以實(shí)現(xiàn)生物目標(biāo)的定量（圖1）。
 

圖1 基于ARET的比率余輝納米平臺(tái)的示意圖

2.多個(gè)比率余輝納米探針的設(shè)計(jì)
通過(guò)引入不同的響應(yīng)分子作為能量受體，可輕松制備各種可激活的比率余輝納米探針。在概念驗(yàn)證研究中，研究人員設(shè)計(jì)了一氧化氮（NO）響應(yīng)性的納米探針RAN1，然后系統(tǒng)研究了它對(duì)NO的響應(yīng)。正如預(yù)期的那樣，隨著NO濃度的增加，RAN1在600nm處的余輝發(fā)光（AF1）減弱，而在830nm處的余輝發(fā)光（AF2）增強(qiáng)，表現(xiàn)出RAN1對(duì)NO的響應(yīng)，而且余輝比（AF2/AF1）與NO濃度呈線性相關(guān)。這些結(jié)果表明，RAN1是一種出色的納米探針，可用于NO的余輝成像，并具有高的靈敏度和特異性。

為了證明這個(gè)納米平臺(tái)的通用性，研究人員又開(kāi)發(fā)出兩種納米探針RAN2和RAN3，來(lái)響應(yīng)過(guò)氧亞硝基陰離子（ONOO⁻）和pH（圖2）。分析結(jié)果表明，基于ARET的策略也適用于ONOO⁻或pH的靈敏檢測(cè)和成像，這進(jìn)一步證實(shí)了比率余輝納米平臺(tái)在開(kāi)發(fā)余輝探針上的可行性和普適性。
 

圖2 余輝探針對(duì)不同分子的響應(yīng)

值得注意的是，后續(xù)的實(shí)驗(yàn)表明，這些比率余輝探針不僅可解決余輝強(qiáng)度的衰減問(wèn)題，消除激光功率、輻照時(shí)間和曝光時(shí)間的干擾，而且還顯著提高了體內(nèi)成像的可靠性和信噪比（約1200倍）。

3.利用比率余輝成像來(lái)評(píng)估巨噬細(xì)胞極化
為了驗(yàn)證RAN1對(duì)NO成像的能力，研究人員在LPS誘導(dǎo)的肝損傷實(shí)驗(yàn)中使用Nos2^−/−小鼠作為對(duì)照（該Nos2^−/−小鼠購(gòu)自賽業(yè)生物）。對(duì)于WT小鼠，LPS的處理可顯著提高余輝強(qiáng)度比（AF2/AF1），表明LPS孵育的小鼠肝臟中的NO含量較高。但對(duì)于Nos2^−/−小鼠，LPS的處理并沒(méi)有引起AF2/AF1顯著增加，這是由于Nos2基因的敲除導(dǎo)致NO無(wú)法產(chǎn)生。由此可見(jiàn)，RAN1能夠通過(guò)比率余輝成像檢測(cè)活體小鼠的內(nèi)源性NO。

在此基礎(chǔ)上，他們預(yù)計(jì)RAN1有潛力對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞的極化進(jìn)行成像。他們使用多種調(diào)節(jié)劑來(lái)誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞極化，將腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAM）轉(zhuǎn)化為殺傷腫瘤的M1表型，從而影響內(nèi)源性NO水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，使用比率余輝成像，RAN1能夠?qū)崟r(shí)檢測(cè)巨噬細(xì)胞極化過(guò)程中的NO變化，作為評(píng)估極化程度的有效參數(shù)（圖3）。這種比率信號(hào)可作為無(wú)創(chuàng)預(yù)測(cè)因子來(lái)實(shí)時(shí)評(píng)估巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤免疫治療的效果。
 

圖3 巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的免疫治療的余輝成像

研究結(jié)論
綜上，研究人員受到FRET的啟發(fā)，設(shè)計(jì)出一種通用的比率余輝納米平臺(tái)�；�于ARET的比率探針不僅克服了余輝強(qiáng)度的衰減，消除了其他因素的干擾，而且表現(xiàn)出更高的成像可靠性，可用于分析物的定量分析。未來(lái)，這種納米平臺(tái)有望應(yīng)用于巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的免疫療法的無(wú)創(chuàng)評(píng)估，或活體動(dòng)物中免疫治療調(diào)節(jié)劑的高通量篩選。