冠狀動(dòng)脈疾病是全球范圍內(nèi)，引起較高發(fā)病率和死亡率的重要原因之一。經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療和溶栓治療是目前使用最廣泛的治療干預(yù)措施。盡管這些方法可以減少心肌梗死面積，但再灌注本身又會(huì)誘發(fā)心臟缺血/再灌注（I/R）損傷。目前臨床上對(duì)心臟缺血/再灌注損傷尚無有效的治療方法，因此對(duì)I/R損傷機(jī)制的研究以及新的治療靶點(diǎn)的開發(fā)，具有重要的臨床意義。

哈爾濱醫(yī)科大學(xué)潘振偉教授領(lǐng)導(dǎo)的研究團(tuán)隊(duì)近日發(fā)現(xiàn)一種長(zhǎng)鏈非編碼RNA（CIRKIL）通過與Ku70蛋白相互作用而加劇心臟缺血/再灌注損傷，因此有望成為新的治療靶點(diǎn)。這項(xiàng)研究成果發(fā)表在心血管領(lǐng)域頂級(jí)期刊《Circulation Research》上。
 

研究材料與方法
研究人員在本次研究中使用了CIRKIL轉(zhuǎn)基因小鼠和基因敲除小鼠（其中CIRKIL轉(zhuǎn)基因小鼠和基因敲除小鼠由賽業(yè)生物構(gòu)建），建立了心肌缺血/再灌注模型。他們采用RNA pull-down和RNA免疫沉淀分析來檢測(cè)CIRKIL與Ku70之間的相互作用。

技術(shù)路線
01分析CIRKIL在心臟I/R損傷中的作用
02確定CIRKIL的蛋白伴侶Ku70
03探討CIRKIL加劇心臟I/R損傷的機(jī)制

研究結(jié)果
1.CIRKIL的過表達(dá)加重心臟損傷
DNA雙鏈斷裂（DSB）可通過激活DNA損傷反應(yīng)通路誘發(fā)嚴(yán)重的心肌病。Ku70蛋白是DNA損傷修復(fù)的重要調(diào)控因子，但其在心臟I/R損傷中的作用仍不清楚。研究團(tuán)隊(duì)之前發(fā)現(xiàn)一種高度保守的lncRNA在心肌梗死中上調(diào)，于是他們想了解這種稱為CIRKIL的lncRNA如何調(diào)控心臟I/R損傷。

研究人員首先通過體內(nèi)和體外分析發(fā)現(xiàn)在I/R心臟和H2O2處理的心肌細(xì)胞中CIRKIL的表達(dá)增加。為了弄清CIRKIL在心臟I/R損傷中的作用，他們使用了過表達(dá)CIRKIL的轉(zhuǎn)基因小鼠（其中過表達(dá)CIRKIL轉(zhuǎn)基因小鼠由賽業(yè)生物構(gòu)建）。與對(duì)照相比，過表達(dá)CIRKIL加重了I/R小鼠的心臟功能障礙，具體表現(xiàn)為擴(kuò)大了梗死面積，并加重了心肌細(xì)胞損傷。同時(shí)，在CIRKIL敲除小鼠上開展的實(shí)驗(yàn)表明，CIRKIL的敲除可減少心肌梗死面積，降低心肌細(xì)胞凋亡，并減輕心肌I/R損傷。

2.CIRKIL與Ku70相互作用并抑制其核易位
lncRNA可以通過與特定的蛋白伴侶結(jié)合來調(diào)節(jié)基因表達(dá)和發(fā)揮生物學(xué)功能。于是，研究人員采用RNA pull-down分析鑒定CIRKIL的潛在結(jié)合蛋白。實(shí)驗(yàn)結(jié)果中包含Ku70，該蛋白是細(xì)胞核中參與DNA損傷修復(fù)的關(guān)鍵分子。那么，CIRKIL在I/R損傷和H2O2誘導(dǎo)的損傷中的有害作用是不是是通過Ku70介導(dǎo)的呢？

他們開展了RNA pull-down實(shí)驗(yàn)和Western blot實(shí)驗(yàn)，結(jié)果證實(shí)CIRKIL與Ku70蛋白之間確實(shí)存在相互作用（圖1）。CIRKIL的敲除增加了Ku70在細(xì)胞核內(nèi)的分布，而CIRKIL的過表達(dá)阻止了Ku70在心肌細(xì)胞中的核易位，這表明CIRKIL與Ku70的結(jié)合干擾了Ku70的核易位。
 

圖1. CIRKIL與Ku70相互作用并抑制Ku70的核易位

3.Ku70介導(dǎo)了CIRKIL對(duì)心臟損傷的影響
之后，研究人員通過功能獲得和功能缺失兩種方法研究了Ku70對(duì)心肌細(xì)胞損傷的影響。結(jié)果表明，Ku70的敲低顯著加重了H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷，而且組蛋白H2A.X（γH2A.X）的水平進(jìn)一步增加，γH2A.X是DNA雙鏈斷裂的特異性標(biāo)志物。同時(shí)，Ku70過表達(dá)有效減輕了H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷。這些數(shù)據(jù)表明，Ku70在心臟I/R損傷中扮演保護(hù)角色。

接下來，研究人員探討了Ku70是否介導(dǎo)CIRKIL對(duì)心臟損傷的影響。他們通過測(cè)定組蛋白H2A.X（γH2A.X）的水平來評(píng)估CIRKIL的過表達(dá)或敲除是否影響DNA雙鏈斷裂修復(fù)。CIRKIL的過表達(dá)增加了γH2A.X的表達(dá)，而CIRKIL的敲除引起了相反的變化，該結(jié)果表明CIRKIL可以調(diào)控雙鏈斷裂修復(fù)。

Ku70的過表達(dá)阻止了CIRKIL過表達(dá)對(duì)心肌細(xì)胞活力的抑制作用，消除了γH2A.X的上調(diào)并引起心肌細(xì)胞凋亡。以上的數(shù)據(jù)表明，CIRKIL對(duì)心臟I/R損傷的有害影響是通過抑制Ku70核易位實(shí)現(xiàn)的（圖2）。研究人員還確定，CIRKIL上的1030-1130 nt序列是其功能結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)CIRKIL與Ku70的結(jié)合。
 

圖2. CIRKIL調(diào)控心臟損傷的示意圖

總結(jié)
在這項(xiàng)研究中，研究人員首次發(fā)現(xiàn)CIRKIL通過與Ku70相互作用而加劇心肌I/R損傷。它通過抑制Ku70的核易位和破壞雙鏈斷裂修復(fù)來促進(jìn)細(xì)胞凋亡。這些結(jié)果揭示了lncRNA在心臟I/R損傷中的作用，還提示CIRKIL和Ku70這兩個(gè)位點(diǎn)有可能成為預(yù)防和治療心臟I/R損傷的新靶點(diǎn)。

原文檢索：
Xiao H, Zhang M, Wu H, Wu J, Hu X, Pei X, Li D, Zhao L, Hua Q, Meng B, Zhang X, Peng L, Cheng X, Li Z, Yang W, Zhang Q, Zhang Y, Lu Y, Pan Z. CIRKIL Exacerbates Cardiac Ischemia/Reperfusion Injury by Interacting With Ku70. Circ Res. 2022 Mar 4;130(5):e3-e17. doi: 10.1161/CIRCRESAHA.121.318992. Epub 2022 Feb 2. PMID: 35105170.