罕見病囊性纖維化致病基因：CFTR基因及其小鼠模型
六英尺，雖然不遠(yuǎn)，但也是讓人無法觸手可及的距離。電影《五尺天涯》中，就講述了一個(gè)因雙方患有囊腫性纖維化疾病，而不得不在六尺距離規(guī)則下進(jìn)行的愛情故事。在這呢，就不得不提到一個(gè)與之密切聯(lián)系的基因——CFTR基因。CFTR基因可以激活氯離子通路，也可以調(diào)控其他離子通路，因而可以對細(xì)胞的整體鹽和水分起到調(diào)控作用。該基因的異常表達(dá)，會(huì)導(dǎo)致囊性纖維化的發(fā)生，使患者在氣道、胰腺、小腸等通道中產(chǎn)生粘稠液體。該病是一種進(jìn)行性疾病，更是一種罕見病。
賽業(yè)生物《每周一鼠》，每周為大家講解一個(gè)小鼠模型的故事，希望對大家了解不同的小鼠模型有所幫助。今天和大家見面的是CFTR基因編輯小鼠。
⭐ CFTR基因介紹
CFTR基因是由12跨膜區(qū)域、兩個(gè)核苷酸結(jié)合區(qū)域（NBD1/2）和一個(gè)調(diào)節(jié)R區(qū)域組成，該基因與囊性纖維化具有緊密的聯(lián)系。其激活需要cAMP介導(dǎo)，而NBD區(qū)域會(huì)與ATP結(jié)合。但也有研究指出，CFTR可以通過不依賴cAMP的途徑激活。
CFTR在調(diào)控離子通路的過程中發(fā)揮重要的作用。其基因主要介導(dǎo)了細(xì)胞內(nèi)氯離子跨膜向細(xì)胞外運(yùn)動(dòng)，同時(shí)伴隨水分子的轉(zhuǎn)運(yùn)。除了本身能介導(dǎo)氯離子的外流之外，CFTR還能通過ROMK2介導(dǎo)鉀離子向細(xì)胞外的運(yùn)輸，ROMK2能與細(xì)胞內(nèi)的NBD1和調(diào)控R結(jié)構(gòu)域相互作用。此外，CFTR還能通過結(jié)合ATP到PY2R蛋白上調(diào)控ORCC介導(dǎo)的氯離子外流通道，并且能抑制ENaC蛋白活性進(jìn)而調(diào)控鈉離子的內(nèi)流。
⭐ CFTR相關(guān)疾病介紹
囊性纖維化（cystic fibrosis，CF）是一種遺傳性疾病，會(huì)對肺部、消化系統(tǒng)和身體其他器官造成嚴(yán)重?fù)p害。由于囊性纖維化跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)蛋白位于多種腺體的上皮細(xì)胞的頂部質(zhì)膜中，因而該病會(huì)影響不同種類的分泌細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞液，使患者細(xì)胞分泌的粘液變得粘稠；無法對細(xì)胞表面進(jìn)行潤滑，還會(huì)導(dǎo)致管路堵塞，尤其是在肺部和胰腺。
⭐ CFTR基因敲除小鼠
人與小鼠在氨基酸序列的同源性是78%，研究人員通過在該基因10號(hào)外顯子中插入終止密碼子（S489X），制備了第一種CFTR敲除小鼠（CFTRtm1UNC）。另外，研究人員還通過其他方法得到CFTR全基因敲除小鼠，如CFTRtm1CAM、CFTRtm1HSC、CFTRtm1BAY和CFTRtm3BAY，這些小鼠品系都檢測不到野生型CFTR的mRNA。除了敲除模型，不同的實(shí)驗(yàn)室也構(gòu)建許多點(diǎn)突變的模型。一些會(huì)導(dǎo)致CF的突變也引入小鼠CFTR中產(chǎn)生Class II突變的△F508小鼠模型（CFTRtm1EUR、CFTRtm1KTH和CFTRtm2CAM）、G480C突變的模型（CFTRtm2HGU）和Class III突變的G551D小鼠模型（CFTRtm1G551D）。
有研究指出，使用小鼠模型研究囊性纖維化具有較容易構(gòu)建、繁育周期短以及飼養(yǎng)成本低優(yōu)點(diǎn)。然而，使用小鼠模型研究囊性纖維化也有一些限制，比如小鼠模型無法在未攻毒的情況下產(chǎn)生自發(fā)性肺部感染。并且大部分小鼠模型的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在小鼠胰腺、肝臟和輸精管只有輕微并發(fā)癥，這與人的表型嚴(yán)重程度具有很大差異。造成這種結(jié)果的原因可能是因?yàn)榈捅磉_(dá)量的CFTR可能產(chǎn)生足夠的離子轉(zhuǎn)運(yùn)能力使得小鼠模型的嚴(yán)重程度比較低，此外，小鼠中存在另外的上皮表達(dá)的氯離子通道可以代償CFTR的離子通道功能。
Gawenis等人通過BAC轉(zhuǎn)基因的方式制備了表達(dá)人源CFTR的小鼠，轉(zhuǎn)入了人源CFTR基因（約6拷貝）的鼠源CFTR，敲除小鼠的相關(guān)表型得到了挽救。
⭐ 總結(jié)
CFTR基因可以激活氯離子通路，也可以調(diào)控其他離子通路，因而可以對細(xì)胞的整體鹽和水分起到調(diào)控作用。該基因異常會(huì)導(dǎo)致囊性纖維化，在氣道、胰腺、小腸等通道中產(chǎn)生粘稠液體。通過研發(fā)構(gòu)建這種罕見病的相關(guān)模型，對于其治療藥物的開發(fā)具有重要意義。
⭐ 參考文獻(xiàn)：
1. https://rddc.tsinghua-gd.org/details/gene?gene=Jmallx
2. Lavelle GM, White MM, Browne N, McElvaney NG, Reeves EP. Animal Models of Cystic Fibrosis Pathology: Phenotypic Parallels and Divergences. Biomed Res Int. 2016;2016:5258727. doi: 10.1155/2016/5258727. Epub 2016 Jun 1.
3. Rosen BH, Chanson M, Gawenis LR, Liu J, Sofoluwe A, Zoso A, Engelhardt JF. Animal and model systems for studying cystic fibrosis. J Cyst Fibros. 2018 Mar;17(2S):S28-S34. doi: 10.1016/j.jcf.2017.09.001. Epub 2017 Sep 19.
4. Gawenis LR, Hodges CA, McHugh DR, Valerio DM, Miron A, Cotton CU, Liu J, Walker NM, Strubberg AM, Gillen AE, Mutolo MJ, Kotzamanis G, Bosch J, Harris A, Drumm ML, Clarke LL. A BAC Transgene Expressing Human CFTR under Control of Its Regulatory Elements Rescues Cftr Knockout Mice. Sci Rep. 2019 Aug 14;9(1):11828. doi: 10.1038/s41598-019-48105-4.
5. Fabbri E, Tamanini A, Jakova T, Gasparello J, Manicardi A, Corradini R, Sabbioni G, Finotti A, Borgatti M, Lampronti I, Munari S, Dechecchi MC, Cabrini G, Gambari R. A Peptide Nucleic Acid against MicroRNA miR-145-5p Enhances the Expression of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) in Calu-3 Cells. Molecules. 2017 Dec 29;23(1):71. doi: 10.3390/molecules23010071.
賽業(yè)生物《每周一鼠》，每周為大家講解一個(gè)小鼠模型的故事，希望對大家了解不同的小鼠模型有所幫助。今天和大家見面的是CFTR基因編輯小鼠。
⭐ CFTR基因介紹
CFTR基因是由12跨膜區(qū)域、兩個(gè)核苷酸結(jié)合區(qū)域（NBD1/2）和一個(gè)調(diào)節(jié)R區(qū)域組成，該基因與囊性纖維化具有緊密的聯(lián)系。其激活需要cAMP介導(dǎo)，而NBD區(qū)域會(huì)與ATP結(jié)合。但也有研究指出，CFTR可以通過不依賴cAMP的途徑激活。
CFTR在調(diào)控離子通路的過程中發(fā)揮重要的作用。其基因主要介導(dǎo)了細(xì)胞內(nèi)氯離子跨膜向細(xì)胞外運(yùn)動(dòng)，同時(shí)伴隨水分子的轉(zhuǎn)運(yùn)。除了本身能介導(dǎo)氯離子的外流之外，CFTR還能通過ROMK2介導(dǎo)鉀離子向細(xì)胞外的運(yùn)輸，ROMK2能與細(xì)胞內(nèi)的NBD1和調(diào)控R結(jié)構(gòu)域相互作用。此外，CFTR還能通過結(jié)合ATP到PY2R蛋白上調(diào)控ORCC介導(dǎo)的氯離子外流通道，并且能抑制ENaC蛋白活性進(jìn)而調(diào)控鈉離子的內(nèi)流。
圖1. CFTR基因相關(guān)信息
來源：（https://rddc.tsinghua-gd.org/）
來源：（https://rddc.tsinghua-gd.org/）
⭐ CFTR相關(guān)疾病介紹
囊性纖維化（cystic fibrosis，CF）是一種遺傳性疾病，會(huì)對肺部、消化系統(tǒng)和身體其他器官造成嚴(yán)重?fù)p害。由于囊性纖維化跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)蛋白位于多種腺體的上皮細(xì)胞的頂部質(zhì)膜中，因而該病會(huì)影響不同種類的分泌細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞液，使患者細(xì)胞分泌的粘液變得粘稠；無法對細(xì)胞表面進(jìn)行潤滑，還會(huì)導(dǎo)致管路堵塞，尤其是在肺部和胰腺。
圖2. CFTR介導(dǎo)的離子通道調(diào)控模式[2]
⭐ CFTR基因敲除小鼠
人與小鼠在氨基酸序列的同源性是78%，研究人員通過在該基因10號(hào)外顯子中插入終止密碼子（S489X），制備了第一種CFTR敲除小鼠（CFTRtm1UNC）。另外，研究人員還通過其他方法得到CFTR全基因敲除小鼠，如CFTRtm1CAM、CFTRtm1HSC、CFTRtm1BAY和CFTRtm3BAY，這些小鼠品系都檢測不到野生型CFTR的mRNA。除了敲除模型，不同的實(shí)驗(yàn)室也構(gòu)建許多點(diǎn)突變的模型。一些會(huì)導(dǎo)致CF的突變也引入小鼠CFTR中產(chǎn)生Class II突變的△F508小鼠模型（CFTRtm1EUR、CFTRtm1KTH和CFTRtm2CAM）、G480C突變的模型（CFTRtm2HGU）和Class III突變的G551D小鼠模型（CFTRtm1G551D）。
圖3. CFTR基因突變小鼠模型[2]
有研究指出，使用小鼠模型研究囊性纖維化具有較容易構(gòu)建、繁育周期短以及飼養(yǎng)成本低優(yōu)點(diǎn)。然而，使用小鼠模型研究囊性纖維化也有一些限制，比如小鼠模型無法在未攻毒的情況下產(chǎn)生自發(fā)性肺部感染。并且大部分小鼠模型的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在小鼠胰腺、肝臟和輸精管只有輕微并發(fā)癥，這與人的表型嚴(yán)重程度具有很大差異。造成這種結(jié)果的原因可能是因?yàn)榈捅磉_(dá)量的CFTR可能產(chǎn)生足夠的離子轉(zhuǎn)運(yùn)能力使得小鼠模型的嚴(yán)重程度比較低，此外，小鼠中存在另外的上皮表達(dá)的氯離子通道可以代償CFTR的離子通道功能。
Gawenis等人通過BAC轉(zhuǎn)基因的方式制備了表達(dá)人源CFTR的小鼠，轉(zhuǎn)入了人源CFTR基因（約6拷貝）的鼠源CFTR，敲除小鼠的相關(guān)表型得到了挽救。
圖4. 人源化小鼠的構(gòu)建方案[4]
⭐ 總結(jié)
CFTR基因可以激活氯離子通路，也可以調(diào)控其他離子通路，因而可以對細(xì)胞的整體鹽和水分起到調(diào)控作用。該基因異常會(huì)導(dǎo)致囊性纖維化，在氣道、胰腺、小腸等通道中產(chǎn)生粘稠液體。通過研發(fā)構(gòu)建這種罕見病的相關(guān)模型，對于其治療藥物的開發(fā)具有重要意義。
⭐ 參考文獻(xiàn)：
1. https://rddc.tsinghua-gd.org/details/gene?gene=Jmallx
2. Lavelle GM, White MM, Browne N, McElvaney NG, Reeves EP. Animal Models of Cystic Fibrosis Pathology: Phenotypic Parallels and Divergences. Biomed Res Int. 2016;2016:5258727. doi: 10.1155/2016/5258727. Epub 2016 Jun 1.
3. Rosen BH, Chanson M, Gawenis LR, Liu J, Sofoluwe A, Zoso A, Engelhardt JF. Animal and model systems for studying cystic fibrosis. J Cyst Fibros. 2018 Mar;17(2S):S28-S34. doi: 10.1016/j.jcf.2017.09.001. Epub 2017 Sep 19.
4. Gawenis LR, Hodges CA, McHugh DR, Valerio DM, Miron A, Cotton CU, Liu J, Walker NM, Strubberg AM, Gillen AE, Mutolo MJ, Kotzamanis G, Bosch J, Harris A, Drumm ML, Clarke LL. A BAC Transgene Expressing Human CFTR under Control of Its Regulatory Elements Rescues Cftr Knockout Mice. Sci Rep. 2019 Aug 14;9(1):11828. doi: 10.1038/s41598-019-48105-4.
5. Fabbri E, Tamanini A, Jakova T, Gasparello J, Manicardi A, Corradini R, Sabbioni G, Finotti A, Borgatti M, Lampronti I, Munari S, Dechecchi MC, Cabrini G, Gambari R. A Peptide Nucleic Acid against MicroRNA miR-145-5p Enhances the Expression of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) in Calu-3 Cells. Molecules. 2017 Dec 29;23(1):71. doi: 10.3390/molecules23010071.
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