干貨分享：Cre-loxP位點特異性重組系統(tǒng)條件性靶基因功能

瀏覽次數(shù)：3130　發(fā)布日期：2021-10-19　來源：本站　僅供參考，謝絕轉(zhuǎn)載，否則責任自負

基因編輯小鼠模型是當今研究基因功能和致病機制的利器。業(yè)界重量級資深技術(shù)大咖為您詳細解析：為何應(yīng)充分了解與關(guān)注基因編輯小鼠模型應(yīng)用中存在的某些風險與影響因素，如何設(shè)計有助于提升基因編輯小鼠模型研究結(jié)果的準確性與可靠性。精彩好文，全是干貨，不可錯過！

作者簡介：

俞曉峰博士
賽業(yè)生物首席科學家、副總裁

俞曉峰博士現(xiàn)為賽業(yè)生物首席科學家與副總裁，負責基因修飾模式動物的研發(fā)與技術(shù)服務(wù)等。俞博士在基因修飾模式動物領(lǐng)域有超過20年以上研發(fā)與管理等方面的豐富經(jīng)驗，在干細胞相關(guān)領(lǐng)域及哺乳動物細胞系基因改造研究也取得了巨大成就，其研究成果多次發(fā)表在Nature Immunology、Hum Mol Genet.、Mol Cell Biol.等高水平雜志上。

加入賽業(yè)生物前，俞博士于2010-2013年任職于美國應(yīng)用干細胞（ASC）公司，擔任研發(fā)總監(jiān)，負責基因修飾模式動物的研發(fā)與定制服務(wù)，并任中國子公司斯坦福生物科技公司副總裁。2009-2010年任紐約大學醫(yī)學院研究員。2003-2009年任職于美國基因打靶公司（iTL），作為資深科學家和項目經(jīng)理，負責及參與基因修飾小鼠模型研發(fā)與定制技術(shù)服務(wù)的策略與方案設(shè)計、項目管理、技術(shù)人員指導(dǎo)與培訓、客戶服務(wù)與技術(shù)咨詢等工作，2007年負責開發(fā)了人源化p53基因突變的腫瘤小鼠模型庫構(gòu)建項目。2000年任美國耶魯大學醫(yī)學院研究員。1995年獲得軍事醫(yī)學科學院博士學位。

前言
應(yīng)用基因編輯小鼠模型研究基因的功能、揭示疾病致病機制過程，為藥物研發(fā)的臨床前研究，發(fā)揮了不可取代的作用。而Cre-loxP位點特異性重組系統(tǒng)（簡稱Cre-loxP重組系統(tǒng)）的建立，為完善基因編輯小鼠模型的構(gòu)建，進一步開展條件性靶基因功能的研究，提供了有效工具。回顧Cre-loxP重組系統(tǒng)在小鼠研究中的實際應(yīng)用，研究者們認識到，對該技術(shù)應(yīng)用中存在的某些風險與影響因素，給予充分了解與關(guān)注，將有助于提升靶基因編輯小鼠模型研究結(jié)果的準確性與可靠性。

一、Cre-loxP位點特異性重組系統(tǒng)應(yīng)用基本原理
所謂Cre-loxP位點特異性重組系統(tǒng)，源于噬菌體P1中，存在Cre重組酶（343個氨基酸蛋白，4個亞單位組成）及其能特異識別的一對34 bp的DNA序列（即loxP位點），并根據(jù)兩個loxP位點的方向性，將兩loxP位點之間的DNA序列（也稱floxed區(qū)域）進行特異性重組切割或反轉(zhuǎn)。

如果在相應(yīng)細胞/組織內(nèi)特異性表達Cre重組酶, 且細胞/組織內(nèi)也含兩個loxP位點序列的floxed靶區(qū)域，則可使Cre-loxP系統(tǒng)的重組作用，局限于特定細胞或組織，實現(xiàn)體內(nèi)靶基因特異性敲除或表達的目的。 T細胞特異性Cre轉(zhuǎn)基因小鼠最先構(gòu)建，為條件性靶基因在T細胞中的功能研究提供了條件。

二、應(yīng)用Cre-loxP位點特異性重組系統(tǒng)，實現(xiàn)小鼠條件性靶基因功能研究
要想實現(xiàn)小鼠條件性靶基因編輯及功能相關(guān)研究，前提是分別獲得兩種小鼠模型：即構(gòu)建含兩個loxP位點序列floxed靶基因的小鼠和細胞/組織特異性表達Cre小鼠。比如，為了開展某靶基因的條件性敲除（CKO)研究, 首先要構(gòu)建該靶基因的打靶載體，即將兩個loxP位點分別克隆到該靶基因DNA區(qū)域的兩端，再借助CRISPR/Cas 受精卵注射或賽業(yè)生物TurboKnockout囊胚注射技術(shù)，建立所謂的靶基因floxed小鼠，即小鼠模型在某靶基因計劃敲除的特定floxed區(qū)域，已經(jīng)攜帶了兩個同向的loxP位點。將該floxed小鼠與某特定細胞/組織特異性表達的Cre小鼠進行交配，就能獲得該靶基因在此特定細胞/組織敲除的小鼠模型。

最終完成Cre-loxP系統(tǒng)條件性靶基因編輯小鼠研制的操作，通常需要通過floxed小鼠與相應(yīng)Cre小鼠間的兩步遺傳交配繁殖過程。第一步交配，X基因Cre雜合小鼠（X基因Cre/+）與Y基因 floxed雜合小鼠（Y基因 lox/+，即CKO打靶Y基因)，或Y基因 floxed純合小鼠（Y基因lox/lox）交配，獲得X基因Cre/+; Y基因lox/+ 后代雜合小鼠。第二步交配，將X基因Cre/+; Y基因lox/+雜合小鼠，再與Y基因lox/+雜合小鼠，或Y基因lox/lox純合小鼠交配，從而獲得最終X基因Cre/+；Y基因lox/lox條件性打靶小鼠。

如果Cre表達是嚴格調(diào)控的，且無生殖系統(tǒng)或發(fā)育過程表達現(xiàn)象，第二步交配的后代小鼠, 只有X基因Cre/+; Y基因lox/lox小鼠，可作為條件性靶基因打靶的小鼠模型研究，即Y基因的兩個等位基因，在Cre重組酶特異性表達活性的組織細胞中，被有效重組切割的目的。

然而，如果Cre存在生殖系統(tǒng)泄露表達情況，在第一步交配后，有可能對X基因Cre/+; Y基因lox/+雜合小鼠，進行生殖性重組切割作用，產(chǎn)生X基因Cre/+; Y基因Δ/+小鼠（Δ代表Y基因某個等位基因在某些細胞或所有細胞敲除），這樣的話，第二步交配，就是X基因Cre/+; Y基因Δ/+雜合小鼠，與Y基因lox/+雜合小鼠，或Y基因lox/lox純合小鼠進行交配。如果此時，還是用常規(guī)兩個引物的PCR鑒定策略，很難鑒別出非預(yù)期的生殖系基因敲除現(xiàn)象，必需借助設(shè)計三個引物組合的PCR鑒定策略加以確定。

三、不同Cre小鼠模型構(gòu)建策略及方法特點
目前有四種常見Cre小鼠模型構(gòu)建策略及方法，雖然每種方法都有其優(yōu)勢與不足，也很難說那種策略方法，能夠適合或滿足所有研究目的。所以，最終選擇哪種方法，還是要根據(jù)研究目的具體情況決定。

1. 質(zhì)粒表達載體的轉(zhuǎn)基因Cre小鼠模型：認為是Cre小鼠構(gòu)建的傳統(tǒng)方法，因為最初的Cre小鼠模型，多是應(yīng)用特定啟動子加Cre基因cDNA的質(zhì)粒載體，通過受精卵原核注射法，獲得Cre隨機插入基因組的轉(zhuǎn)基因小鼠。

由于啟動子大小的限制，只選擇了一定范圍的表達調(diào)控元件序列，構(gòu)建Cre表達載體，加上轉(zhuǎn)基因隨機插入基因組的位置效應(yīng)影響、拷貝數(shù)的差異、以及內(nèi)源基因可能破壞等因素，使每個Cre首建鼠存在個體差異，且需要通過對每個首建鼠特征進行篩選與鑒定，獲得特定理想的Cre轉(zhuǎn)基因小鼠模型。因此，通過傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因技術(shù)構(gòu)建的Cre小鼠模型，出現(xiàn)所謂Cre作用的“脫靶（off-target）” 活性，也就不奇怪了。

2. 定點敲入Cre小鼠模型：將Cre基因定點敲入相關(guān)內(nèi)源基因位點，借助內(nèi)源性基因調(diào)控序列確定Cre表達特征，已成為傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因Cre小鼠構(gòu)建的替代選擇，也增加了Cre基因表達活性的精確性。

應(yīng)用CRISPR/Cas或賽業(yè)生物TurboKnockout的ES打靶技術(shù)方法，將單拷貝Cre定點敲入相關(guān)內(nèi)源基因位點，按以下幾種策略方式敲入：（1）. 特定內(nèi)源基因翻譯啟始位點; （2）. 借助IRES序列連接，將Cre基因敲入內(nèi)源基因的3’ UTR區(qū)域；（3）. 借助2A“自切割”肽連接，將Cre基因替換并敲入內(nèi)源基因的終止密碼處。

一般而言，直接將Cre敲入特定內(nèi)源基因的翻譯啟始位點的策略，往往會同時破壞了該基因的表達。有研究發(fā)現(xiàn)，因Cre敲入到生長發(fā)育或疾病通路等至關(guān)重要相關(guān)基因中，導(dǎo)致相應(yīng)Cre小鼠，出現(xiàn)影響基因功能的潛在非特異性表型。比如，Foxg1-Cre敲入小鼠模型，雜合Cre小鼠即出現(xiàn)小鼠前腦發(fā)育障礙。所以，該策略只適合于哪些雜合缺失無表型的相關(guān)基因。而應(yīng)用IRES和2A敲入策略，避免了由Cre特定位點敲入，可能引起的雜合缺失表型的不足。

關(guān)于IRES與2A肽兩種連接敲入策略的比較，通常認識是，傳統(tǒng)的IRES敲入策略，幾乎不會影響內(nèi)源基因的功能，但也發(fā)現(xiàn)，由于傳統(tǒng)經(jīng)典的ES打靶過程中，Neo基因表達成分，或去除其后遺留的相關(guān)FRT序列等遺留部分序列，可能會引起內(nèi)源基因3’ UTR區(qū)域結(jié)構(gòu)改變，從而干擾了Cre的表達水平，使其實際表達量會相對低于內(nèi)源基因本身。而新型2A肽連接敲入方式，Cre表達量與其內(nèi)源基因表達幾乎相似，但由于切割2A肽后，遺留的約17-21氨基酸序列，可以附著于內(nèi)源基因c-端蛋白，存在潛在影響內(nèi)源蛋白功能的可能性。已有研究表明，不同的2A肽序列 (P2A, T2A, E2A, F2A) 具有不同自切割效率。盡管如此，應(yīng)用敲入3'端策略，已不斷贏得其吸引力。

3. BAC轉(zhuǎn)基因Cre小鼠模型：將Cre基因先敲入至BAC克隆的特定基因調(diào)控元件序列后，構(gòu)建BAC克隆載體，并將此BAC載體進行受精卵原核注射法，構(gòu)建BAC轉(zhuǎn)基因Cre小鼠模型。雖然該轉(zhuǎn)基因技術(shù)也是隨機整合插入，但其具有降低了質(zhì)粒DNA隨機插入引起的位置效應(yīng)影響，避免了Cre基因5’ 端敲入可能引起的雜合缺失有表型等方面的優(yōu)勢。另外，相對于短啟動子的表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)基因而言，BAC載體包含了更多的基因表達相關(guān)的調(diào)控元件序列，因而更能反映內(nèi)源基因的表達特征。但是，BAC轉(zhuǎn)基因的首建鼠，仍會出現(xiàn)因BAC克隆載體插入位點的不同，而引起Cre表達活性不同的現(xiàn)象。因此，該方法并不能解決傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因技術(shù)的所有不足，比如，插入位點染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的局部影響作用，以及潛在基因插入突變，造成Cre非真實表達等風險。而且，在BAC轉(zhuǎn)基因Cre小鼠構(gòu)建的同時，也可能增加了附帶相應(yīng)基因的拷貝數(shù)，從而干擾了相關(guān)基因功能研究的客觀分析。盡管如此，相對于傳統(tǒng)較小啟動子的Cre表達載體而言，BAC轉(zhuǎn)基因技術(shù)還是具有其明顯的優(yōu)勢。

4. 安全位點敲入Cre小鼠模型：目前最新的Cre小鼠模型構(gòu)建策略。為了避免基因隨機插入可能導(dǎo)致諸多不利因素影響（比如表達位置影響作用及插入突變等），通過將Cre定點敲入到所謂的“安全” 位點，比如 Rosa26、Hprt 和 Hipp 11等位點。其中以Rosa26位點最為常用。

Rosa26位點特點，其本身含有基因轉(zhuǎn)錄的廣泛啟動子，形成mRNA，卻無翻譯蛋白。所以，該基因無特定功能。借用該基因位點本身的特點與優(yōu)勢，有助于構(gòu)建全身表達Cre基因單拷貝定點敲入小鼠模型。而Hprt和Hipp11位點則比較適合構(gòu)建組織特異性敲入Cre小鼠模型。

四、為什么要構(gòu)建誘導(dǎo)性調(diào)控CreERT小鼠模型及其基本特征
前面介紹的Cre小鼠模型，其作用特異性及特征，是由引導(dǎo)Cre表達的基因啟動子特征或構(gòu)建策略方法決定的。由于許多所謂特異性基因的表達，貫穿了整個細胞/組織的胚胎發(fā)育成熟過程。而由這類基因特性啟動子構(gòu)建的所謂細胞/組織特異性Cre小鼠，其Cre活性作用，可能始于小鼠的胚胎時期。如果研究的靶基因又是小鼠生長發(fā)育非常重要的基因，過早實施Cre-loxP重組系統(tǒng)作用，有可能導(dǎo)致胚胎發(fā)育期靶基因的敲除，產(chǎn)生生殖系基因敲除小鼠的結(jié)果，也就難以實現(xiàn)細胞組織的特異性敲除靶基因的目的。所以，如何控制Cre表達的時間，使其成為可被誘導(dǎo)調(diào)控，即通過使用誘導(dǎo)物的方式，可以掌控Cre表達時間，結(jié)合細胞/組織特異性Cre特征，達到時空條件性靶基因敲除/表達的研究目的。

所謂可誘導(dǎo)性調(diào)控CreERT系統(tǒng)，是將Cre基因與雌激素受體（ER）配體結(jié)合域突變體（ERT）融合一起構(gòu)建而成。該ERT只與合成的ER配體結(jié)合，比如4-羥基他莫昔芬（為藥物Tamoxifen的活性代謝物）。在無該誘導(dǎo)劑存在下，CreERT融合蛋白與細胞漿中HSP90結(jié)合，以非活性狀態(tài)存在于細胞漿，無法發(fā)揮Cre-loxP重組系統(tǒng)作用。當對CreERT/floxed小鼠體內(nèi)提供藥物誘導(dǎo)劑Tamoxifen (TAM），Cre蛋白與HSP90蛋白分離，進入細胞核，識別靶基因中的loxP位點，發(fā)揮Cre-loxP位點細胞/組織特異性及時間特定的重組切割作用。

CreERT小鼠為雌激素受體配體結(jié)合域中只有一個突變位點（G521R），目前常用的CreERT2小鼠，則是在相應(yīng)配體結(jié)合域中引入3個突變位點（C400V/M453A/L544A), 大大提高了其對誘導(dǎo)物TAM的敏感性與特異性。

在特定時間和部位發(fā)揮誘導(dǎo)Cre-loxP重組切割作用能力，無疑極大提高了實驗研究的靈活性。同時也增加了研究者實際應(yīng)用該誘導(dǎo)性Cre-loxP特異性重組系統(tǒng)的挑戰(zhàn)性，比如，對于該系統(tǒng)可能出現(xiàn)的包括Cre泄露表達作用，以及可能的毒性作用等，都需要研究者在實際應(yīng)用中倍加謹慎小心。

五、Cre轉(zhuǎn)基因小鼠模型中Cre插入位點鑒定的挑戰(zhàn)與重要性

目前常用的Cre小鼠模型中，采用傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因策略構(gòu)建的小鼠模型仍是占比最大。然而，對于轉(zhuǎn)基因小鼠模型中，基因隨機插入位點的相關(guān)鑒定研究占比非常少。有分析數(shù)據(jù)表明，只有不到5.2% ( 416/8012 ) 轉(zhuǎn)基因小鼠模型，研究報道了基因隨機插入的位點，而其中只有約2.3%（36/1631）轉(zhuǎn)基因Cre小鼠品系，明確分析了其插入位點，提示分析鑒定轉(zhuǎn)基因隨機插入位點所面臨的挑戰(zhàn)性。

為什么需要鑒定分析轉(zhuǎn)基因隨機插入位點？第一，有利于轉(zhuǎn)基因小鼠特定基因型引物的設(shè)計，便于純合Cre小鼠的鑒定；第二，有助于條件性靶基因?qū)嶒炑芯?/span>中，相關(guān)基因型鑒定分析策略及特異性PCR引物設(shè)計；第三，了解可能潛在的插入突變引起的非期望表型，比如隨機插入導(dǎo)致的直接或間接的內(nèi)源基因編碼序列，或附近相關(guān)調(diào)控序列的破壞改變，以及引起反轉(zhuǎn)/復(fù)制等的復(fù)合結(jié)構(gòu)改變等。

應(yīng)用靶向位點擴增（Targeted locus amplification -TLA）技術(shù)，能有效分析鑒定隨機轉(zhuǎn)基因插入位點與插入基因性質(zhì)特征。有研究者應(yīng)用該技術(shù)，對選擇的40多種常用的轉(zhuǎn)基因Cre小鼠模型，進行分析研究發(fā)現(xiàn)，有30種Cre小鼠模型，由于基因的隨機插入，導(dǎo)致了相應(yīng)基因組結(jié)構(gòu)性變化，其中包括24種小鼠出現(xiàn)基因結(jié)構(gòu)的缺失，6種出現(xiàn)結(jié)構(gòu)重復(fù)。 50 % 轉(zhuǎn)基因Cre小鼠內(nèi)源性基因受損，且多表現(xiàn)為DNA大片段缺失和/或插入位點相關(guān)基因結(jié)構(gòu)改變。由于隨機插入導(dǎo)致的基因結(jié)構(gòu)改變，可誘發(fā)非期望的相關(guān)表型，從而影響到Cre-loxP重組特異性靶基因?qū)嶒灲Y(jié)果的準確性。

六、Cre-loxP位點重組系統(tǒng)應(yīng)用中常見風險及影響因素
Cre小鼠模型作用的一致性與可重復(fù)性，是分析解釋實驗結(jié)果可靠性的保證。然而，回顧過去研制的一些Cre小鼠模型，觀察分析其實際應(yīng)用中的情況發(fā)現(xiàn)，不少所謂特異性Cre小鼠模型，其Cre的靶基因切割活性，明顯存在不均勻和/或不一致的現(xiàn)象。比如，MMTV-Cre、Krt19-Cre、Gata4-Cre和Nes-Cre/ERT2小鼠等, 都報道有不同程度泄露表達等非特異性作用效果。

某些Cre小鼠模型，常出現(xiàn)Cre非特異性/非預(yù)期/異位等異常表達現(xiàn)象，從而影響表型結(jié)果分析及解釋的準確性。比如，Myh6-Cre、Ins2-Cre、Vil-Cre、Ddx4-Cre和Pdx1-Cre等。也有些Cre小鼠模型表現(xiàn)有生殖系細胞作用活性，從而引起Cre-loxP重組系統(tǒng)的廣泛而非特異性的切割作用。

關(guān)于Cre小鼠的所謂非特異脫靶重組作用的原因，目前多認為，與如下因素有關(guān)，第一，應(yīng)用不同的Cre小鼠構(gòu)建策略與技術(shù)；第二，Cre小鼠起初研制的時候，研制者很明確其實際應(yīng)用的特殊目的，從而導(dǎo)致對Cre小鼠特征鑒定的關(guān)注點存在偏差，忽略了對其進行全面完整而系統(tǒng)的相關(guān)分析。然而，當這些Cre小鼠模型成為公共應(yīng)用資源后，由于研究者們的廣范圍應(yīng)用，也使人們有更多機會對其期望作用的靶組織，以及作用范圍區(qū)域和多個時間點的細胞/組織類型等重組切割活性，進行更加精確及深入的實驗研究。

Cre小鼠令人困惑的潛在非特異性作用的脫靶活性風險，以及引起可能的毒性作用，不僅可導(dǎo)致靶基因敲除小鼠的死亡，或非靶基因敲除引起的非特異性表型。由于這類Cre小鼠引起的脫靶活性作用，其實已代表了Cre的真正活性作用，自然也限制了這類小鼠模型，未來進一步應(yīng)用的價值。

1. Cre非特異性/錯誤重組作用/隨機插入突變的影響因素
目前常用的Cre小鼠模型多為傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因技術(shù)構(gòu)建，即采用所謂細胞/組織特異性的啟動子部分DNA片段策略，加上基因隨機插入，可能產(chǎn)生所謂的基因表達位置效應(yīng)等特征，造成Cre表達的不準確或泄漏，難以真實反映真正期望的特異性，導(dǎo)致Cre表達出現(xiàn)脫靶切割作用。

有研究通過分析常用的幾種胸腺特異性Cre轉(zhuǎn)基因小鼠模型（比如Lck-Cre, CD2-Cre和CD4-Cre）的非特異性作用時發(fā)現(xiàn)，雖然這些小鼠均是應(yīng)用胸腺特異性啟動子構(gòu)建的，但Cre表達，可導(dǎo)致小鼠胸腺細胞量中等或嚴重程度的減少，且表現(xiàn)有劑量和拷貝數(shù)量依賴的特征。

由于Cre重組酶非特異性識別并作用于基因組中與loxP位點相似的序列，也稱隱秘loxP（cloxP) 位點，引起Cre-cloxP位點的非特異性重組切割作用，從而有可能導(dǎo)致重要或關(guān)鍵基因破壞，輕則引起非特異性細胞表型，重則研究組織器官破壞或小鼠死亡。

對Tek-Cre小鼠模型進行基因插入位點分析研究表明，由于Cre的隨機插入，導(dǎo)致241-kb大小DNA缺失, 影響到相關(guān)蛋白編碼基因（比如Mtrr、Fastkd3和Adcy2等）表達，且小鼠出現(xiàn)發(fā)育異常的表型，而該表型可能與Mtrr基因的缺失有關(guān)，因為Mtrr基因敲除小鼠，即可導(dǎo)致后代小鼠發(fā)育嚴重障礙。

另外，在分析某些Cre轉(zhuǎn)基因（比如Ins2-Cre、Nes-Cre、Alb-Cre和Lck-Cre）小鼠模型也發(fā)現(xiàn)，某些非預(yù)期DNA成分出現(xiàn)，比如，人生長激素 (hGH) 微小基因片段。并觀察到Nes-Cre和Ins2-Cre兩種小鼠品系都出現(xiàn)代謝方面的明顯表型，且Ins2-Cre小鼠出現(xiàn)不明原因的，與年齡相關(guān)的糖耐受異常。但Alb-Cre和Lck-Cre兩種小鼠品系，卻未見相似表型。表明hGH微小基因在不同轉(zhuǎn)基因小鼠中，可表現(xiàn)不同的表達及影響作用。

也有報道發(fā)現(xiàn)，在分析的40種轉(zhuǎn)基因Cre小鼠模型中，有10種Cre小鼠伴隨有E.coli DNA序列的污染，DNA片段大小由～300 bp到超過200 kb。且證實，小DNA片段與克隆載體如pBACe3.6相同。出現(xiàn)細菌和載體DNA相互污染的推測原因，可能與注射載體DNA制備過程有關(guān)。但關(guān)于此類污染的影響作用，目前還不太明確。但有研究報道，細菌DNA序列可沉默及影響轉(zhuǎn)基因的表達。

一般認為，隨機插入轉(zhuǎn)基因構(gòu)建Cre小鼠模型的策略與技術(shù)，存在許多不確定的風險。比如，Cre隨機插入，干擾附近內(nèi)源基因表達水平，從而導(dǎo)致Cre作用的所謂脫靶表達現(xiàn)象。

即使應(yīng)用定點敲入策略構(gòu)建Cre小鼠模型，也可能造成相應(yīng)基因表達影響，導(dǎo)致該小鼠模型出現(xiàn)一定的病理改變表型。特別是采用將Cre敲入內(nèi)源基因的5’端構(gòu)建策略。比如，Foxg1-Cre敲入/敲除小鼠，就是在Cre敲入內(nèi)源性Foxg1基因位點同時，也敲除了該基因，而 Foxg1基因參與小鼠大腦半球發(fā)育過程，所以，該Cre純合子小鼠在圍產(chǎn)期死亡。雖然，Foxg1- Cre雜合小鼠，仍可發(fā)揮腦部組織特異性靶向作用，實現(xiàn)小鼠大腦半球、視前/視囊泡、嗅覺上皮神經(jīng)和咽囊部等部位靶基因特異性敲除的目的。

2. Cre重組酶高表達的毒性作用
Cre重組酶在細胞內(nèi)的大量蓄積，可直接引起DNA破壞及細胞死亡。研究已表明，對于高表達Cre的轉(zhuǎn)基因小鼠，表現(xiàn)為其存活及繁殖能力降低。CAG-Cre和CD2-Cre小鼠模型就是典型例子。

Myh6-Cre小鼠是心肌特異性常用小鼠模型, 借助aMyHC啟動子及隨機插入轉(zhuǎn)基因的策略構(gòu)建而成。對比小鼠Cre不同表達水平的影響作用發(fā)現(xiàn)，Cre高表達小鼠發(fā)生非特異性重組作用，從而影響到小鼠心肌的正常功能。而Cre低表達轉(zhuǎn)基因小鼠，則無非特異性重組作用。研究者認為，高表達的Cre與小鼠體內(nèi)某些所謂隱秘loxP(cloxP)位點，發(fā)生非特異性的重組切割效應(yīng)，達到破壞相關(guān)基因功能的作用。

神經(jīng)元細胞中高表達的Cre可引起小鼠腦發(fā)育受損。研究分析Nestin-Cre和兩個Nestin-CreERT2轉(zhuǎn)基因小鼠品系證實，所有純合Nestin-Cre 小鼠，都有胚胎發(fā)育延遲及神經(jīng)元增殖降低、異倍體增加與細胞凋亡病理現(xiàn)象、最終導(dǎo)致小鼠小腦癥和腦積水等發(fā)育缺陷表型。

高水平Cre表達也可直接影響視網(wǎng)膜色素上皮細胞功能。比較分析不同視網(wǎng)膜色素上皮細胞 (RPE) 特異性Cre轉(zhuǎn)基因小鼠后發(fā)現(xiàn)，常用Trp1-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠本身，就伴隨RPE單層細胞結(jié)構(gòu)混亂、RPE區(qū)域萎縮、視網(wǎng)膜感光細胞功能喪失、以及小膠質(zhì)細胞激活等病理變化。

作為代謝性疾病常用的RIP (Ins2)-Cre小鼠，也見有糖耐受反應(yīng)或誘發(fā)糖尿病發(fā)生，并推測可能與胰島素分泌受損有關(guān)。

有報道表明，誘導(dǎo)性腸特異性Villin-CreERT2小鼠，經(jīng)TAM激活后，可借助隱秘loxP位點，引起非特異性DNA破壞作用。

3. Cre生殖系重組作用與小鼠性別影響
通過對64種不同神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)Cre小鼠模型研究發(fā)現(xiàn)，有64.1%小鼠有生殖系重組作用，且29種(占82.8%) 有性別差異，其中父本Cre小鼠有完全或選擇性生殖性重組活性作用占62.1%，而母本Cre小鼠則只占20.1%。只有17.2%的Cre小鼠，具有相似的生殖系重組作用。比如，Foxg1-Cre/floxed 雙基因編輯雄性小鼠與野生雌性小鼠交配的后代，會出現(xiàn)有一定程度生殖細胞基因敲除現(xiàn)象（68.8%），但未見Foxg1-Cre雌性小鼠的生殖細胞作用。

分析這些Cre小鼠出現(xiàn)生殖系重組作用的可能原因及其影響因素，包括小鼠模型構(gòu)建策略技術(shù)本身，比如，轉(zhuǎn)基因還是定點敲入策略、啟動子的選擇、Cre插入位點及表達水平、5’ 端還是3’端敲入、IRES與2A連接方式等都可為潛在影響因素。比如，所謂內(nèi)皮細胞特異性Tek-Cre (Tie2-Cre)轉(zhuǎn)基因小鼠模型，多是借助Tek基因的2.1 kb啟動子加10 kb內(nèi)含子片段區(qū)域構(gòu)建而成。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該Cre表達活性出現(xiàn)于小鼠胚胎7.5天，且表現(xiàn)一定程度造血干細胞系的重組活性。且母本小鼠顯示有明顯的生殖系重組作用。現(xiàn)已證實，因Tek基因調(diào)控序列在胚胎發(fā)育過程及生殖系細胞具有活性作用，從而引起了靶基因在生殖系被敲除的結(jié)果。

4. Cre作用的鑲嵌現(xiàn)象 (Mosaicism)
由于變化或不一致的Cre表達作用，導(dǎo)致同一小鼠體內(nèi)不同細胞或組織中，Cre重組切割作用活性及效率表現(xiàn)差異，因而引起靶基因在不同細胞或組織被敲除的效果，呈現(xiàn)不一致的現(xiàn)象。比如，Vav1-Cre或Fabp4-Cre小鼠品系，其Cre小鼠作用的子代同窩小鼠中，因Cre作用引起的遺傳改變相關(guān)表型，也存在差異的可能性。另外，EIIa-Cre小鼠作為常用的廣泛細胞組織靶基因完全敲除的工具，實際應(yīng)用中也被證實，雄性Ella-Cre小鼠明顯有鑲嵌表達的特性，而雌性Ella-Cre小鼠的重組切割活性, 則更加均勻一致。因而建議用雌性Ella-Cre小鼠與條件性靶向(floxed) 雄性小鼠進行交配，以獲得更為理想而完整的重組切割效果。

5. 小鼠遺傳背景影響作用
研究已發(fā)現(xiàn)，不同遺傳背景的同一Cre小鼠模型，其重組切割活性作用也可不同。比如，眼睛特異性Le-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠所引起的眼睛異常表型，就與其遺傳背景的影響有關(guān)。當該Cre小鼠常用FVB/N品系與CBA/Ca遺傳背景小鼠交配7代后，部分CBA/Ca品系的Le-Cre小鼠，出現(xiàn)明顯眼睛異常表型。且CBA/Ca品系小鼠眼睛表型的嚴重性及出現(xiàn)頻率，也可通過回交FVB小鼠2代而逆轉(zhuǎn)消除。

6. TAM應(yīng)用中相關(guān)問題
CreERT2-loxP位點特異性誘導(dǎo)性重組系統(tǒng)，需要誘導(dǎo)劑TAM參與完成。然而，實際應(yīng)用中，有許多因素可影響其作用效果，并可能引起非特異性及相關(guān)毒副作用，則應(yīng)加以了解關(guān)注與重視。

（1）關(guān)于TAM有效誘導(dǎo)的最優(yōu)劑量與途徑
通過對已報道的CreERT小鼠品系應(yīng)用研究分析中，尋找最佳TAM誘導(dǎo)有效性是比較困難的，部分原因是因為不同研究，應(yīng)用了不同的實驗方案策略與操作流程，包括多種不同的TAM制備及使用劑量，各種給藥途徑等。比如，Columbia大學對相關(guān)研究者們的問卷調(diào)查表明，TAM制備方法（玉米油配制為多，其次為向日葵油和花生油等）、使用劑量（20mg～175 mg等）、給藥途徑及次數(shù)（腹腔注射最多，包括有單次、2-4次和5次等，其次為口服灌胃等）、以及誘導(dǎo)效果檢測方法（RT-PCR和免疫熒光染色為主）等均有明顯不同。

雖然，目前大部分研究都是采用TAM腹腔注射（IP）給藥的方式，但也有研究比較了IP給藥與口服灌胃（PO）給藥方式效果，發(fā)現(xiàn)PO方式在降低TAM毒性方面，可能更有優(yōu)勢。且發(fā)現(xiàn)老年CreERT小鼠，往往需要更高劑量與更長時間TAM誘導(dǎo)，以獲得滿意的CreERT作用活性。

關(guān)于最佳TAM有效誘導(dǎo)劑量與給藥途徑，目前的相關(guān)知識仍很有限，需要繼續(xù)探索與積累。也建議研究者根據(jù)實際具體情況，篩選出適合研究計劃的最佳劑量與途徑。

（2）TAM誘導(dǎo)毒性
目前已經(jīng)明確，高劑量腹腔給藥TAM，有長期毒性作用，可增加小鼠發(fā)病及死亡率。比如，廣泛誘導(dǎo)性R26CreERT2小鼠，如果使用高濃度TAM（175 mg/kg, 口腔連續(xù)5天）誘導(dǎo)，小鼠出現(xiàn)胸腺萎縮、嚴重貧血、以及造血細胞異常染色體重排等造血系統(tǒng)相關(guān)毒性反應(yīng)。

也有研究發(fā)現(xiàn)，心肌特異性誘導(dǎo)表達的MerCreMer (MCM) 轉(zhuǎn)基因小鼠，經(jīng)中高劑量TAM（60～90 ug/g, 腹腔連續(xù)3～5天）處理后，~60-80%的MCM小鼠出現(xiàn)心臟纖維化，且伴有促炎癥細胞因子表達的增加, 最終導(dǎo)致心臟功能衰竭及小鼠死亡。但減少TAM誘導(dǎo)使用劑量或次數(shù)（比如30 ug/g，腹腔連續(xù)3天給藥），不僅可以實現(xiàn)Cre特異性重組作用的最大化（～84%），且最低程度降低其心臟毒性作用的效果。同時，建議應(yīng)用TAM處理的MCM小鼠作為實驗對照。

進一步分析MCM小鼠CreERT轉(zhuǎn)基因插入位點證實，該MCM轉(zhuǎn)基因插入到小鼠基因組染色體19的C1區(qū)域，導(dǎo)致約~20 kb基因組片斷缺失，該片斷包含A1cf基因外顯子1及部分內(nèi)含子1區(qū)域。

關(guān)于TAM誘導(dǎo)MCM小鼠心臟毒性的可能原因，相關(guān)研究認為，TAM誘導(dǎo)的心臟纖維化及心臟衰竭，不是由于MCM的隨機插入位點及TAM使用劑量本身的高低引起的，而是因為中高劑量TAM誘導(dǎo)作用，使Cre表達相應(yīng)增加，從而引起可能的Cre與cloxP隱秘位點的非特異性重組切割有關(guān)。因為，（1）不同年齡的MCM小鼠本身未見心臟纖維化現(xiàn)象；（2）同樣高劑量TAM誘導(dǎo)野生B6小鼠，未見小鼠心臟纖維化改變；（3）高劑量TAM可引起MCM小鼠體內(nèi)心肌細胞程序性死亡增加，且可能與DNA破壞激活及p53基因穩(wěn)定性下降有關(guān)；（4）體外原代細胞證實，高表達Cre重組酶，能直接引起細胞的程序性死亡。

有研究對不同策略構(gòu)建（隨機插入和定點敲入）的兩種誘導(dǎo)性CD4-CreERT2小鼠品系比較分析，通過將其分別與純合Rosa26-loxP-stop-loxP-YFP報告小鼠進行交配，TAM誘導(dǎo)后，觀察體內(nèi)T濾泡輔助細胞（Tfh) 動態(tài)適合反應(yīng)，并用不完全蛋白偶聯(lián)的NP-KLH抗原免疫小鼠，以誘發(fā)輔助性Tfh細胞的分化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高表達CD4-CreERT2隨機插入轉(zhuǎn)基因小鼠，可降低了輔助性Tfh細胞分化數(shù)量，干擾了細胞的存活。而低表達CreERT2的定點敲入小鼠，則能避免因Cre表達過高造成的細胞損失作用，且仍能有效發(fā)揮其淋巴細胞特異性重組效率。

前面介紹的TAM誘導(dǎo)的毒性作用研究報道，多與高劑量TAM使用及高表達Cre作用相關(guān)。但最近有研究表明，低劑量TAM（20 mg/kg）誘導(dǎo)也會影響小鼠骨形成。研究者采用不同劑量TAM（0、20、40和200 mg/kg，腹腔連續(xù)4天）誘導(dǎo)4周齡野生B6小鼠，結(jié)果表明，20 mg/kg劑量TAM誘導(dǎo)，即可引起小鼠股骨體積比（骨體積/總體積）增加153%。因此提示，即使應(yīng)用非常低劑量的TAM誘導(dǎo)，在實際CreERT骨特異性靶基因敲除/表達的研究中，也需要考慮TAM誘導(dǎo)可能影響到小鼠骨小梁和皮質(zhì)骨的形成過程。

七、Cre-loxP位點特異性重組系統(tǒng)應(yīng)用中的思考與建議

Cre小鼠模型構(gòu)建策略與方法不同，直接會影響到Cre-loxP重組系統(tǒng)作用的特異性及其潛在風險。

從起初傳統(tǒng)隨機插入研制技術(shù)構(gòu)建的Cre小鼠品系，發(fā)現(xiàn)該技術(shù)方法自身存在許多不利因素開始，研究者們一直在不斷探索研制更加合理的構(gòu)建策略與方法。

采用BAC介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)目的，是為了提升Cre表達的準確特異性。因為BAC克隆更可能包含內(nèi)源基因的所有調(diào)控元件相關(guān)序列。但是，某些基因表達調(diào)控的遠端順式調(diào)控元件或反式調(diào)控元件，有可能并不存在或包含于所選擇的BAC克隆載體中，從而導(dǎo)致Cre表達無法真正反映內(nèi)源細胞類型或組織特異性。

最終，采取將Cre基因直接敲入到內(nèi)源基因位點的策略，成為目前研制Cre小鼠模型的首選。一般認為，為了更加準確復(fù)制內(nèi)源基因的表達特征，可選擇通過取代內(nèi)源基因編碼序列的方式（比如CD19-Cre）；然而，該定點敲入/敲除策略，有可能會影響/破壞內(nèi)源基因表達。如果該基因為雜合缺失有表型，獲得的雜合敲入Cre小鼠，可能會顯示一定的表型。即使是雜合缺失無表型基因，單等位基因的破壞，在實際應(yīng)用中，也建議避免使用純合Cre小鼠。比如，CD19-Cre敲入/敲除小鼠模型，作為B細胞特異性Cre小鼠，雖然純合小鼠無任何可見的表型，但由于Cre基因的敲入，使該小鼠缺乏B細胞B-1亞型，表現(xiàn)為血清IgM減少，對T細胞依賴抗原反應(yīng)能力嚴重受損，無法形成供B細胞增殖與生長的脾臟生發(fā)中心。因此，如果應(yīng)用純合CD19-Cre小鼠，開展相關(guān)靶基因B細胞特異性敲除研究，自然很難以獲得正確的實驗結(jié)果。

如果為了避免Cre定點敲入基因5‘端，可能引起的不良反應(yīng)，建議選擇將其敲入到內(nèi)源基因編碼區(qū)域外的3' 端非翻譯區(qū)域（UTR）的方式。然而，該定點敲入的構(gòu)建策略，也存在一定的限制。由于多數(shù)基因轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控過程多發(fā)生在其3’UTR區(qū)域，因此，在該區(qū)域的內(nèi)源基因mRNA末端，添加相關(guān)附加基因序列的改變，存在潛在影響內(nèi)源基因表達水平及其特征的可能性。

所以，由于不同構(gòu)建策略方法存在的局限性，有可能產(chǎn)生Cre潛在毒性或干擾相應(yīng)內(nèi)源靶基因的表達，導(dǎo)致Cre-loxP重組系統(tǒng)的非特異性生物學效應(yīng)。為了避免實驗研究中，出現(xiàn)對研究結(jié)果的錯誤解釋，考慮用Cre小鼠，作為實驗對照是有必要的。

2. Cre表達特異性及效率等特征可能與其實際介導(dǎo)的重組切割活性不一致。
報告小鼠已成為驗證確定Cre活性與組織特異性等特征的非常有用工具。該種報告小鼠在其報告基因（如lacZ 或熒光蛋白）前插入兩端都攜帶有loxP位點的終止序列，且這些報告系統(tǒng)多構(gòu)建在特定所謂“安全”位點（比如最為常用的Rosa26位點）。

有研究發(fā)現(xiàn)，科學家們可以通過報告小鼠的驗證，獲得非常完美的所謂Cre小鼠品系，而在實際應(yīng)用中卻發(fā)現(xiàn)，Cre-loxP重組系統(tǒng)的特異性靶基因作用，卻遠不能滿足研究期望目標，表現(xiàn)為該Cre小鼠特異性靶基因切割活性非常不理想或是過分夸張。可能的原因解釋之一，與Rosa26位點本身相對松散的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)特性，從而增加了其與Cre蛋白結(jié)合敏感性等有關(guān)。另外，也有研究表明，某些R26R報告小鼠本身，會出現(xiàn)不依賴Cre重組作用的熒光泄露表達現(xiàn)象，比如，R26R-LSL-Green和R26R-LSL-tdTomato報告小鼠。

其實Cre重組切割活性效率差異，不僅表現(xiàn)在Rosa26位點與實際靶基因位點之間，也表現(xiàn)在不同靶基因之間。提示，由Cre-loxP重組系統(tǒng)介導(dǎo)的切割作用的所謂“敏感性”或效率方面，在每個不同的靶基因作用位點上，都可能表現(xiàn)其獨特性質(zhì)與特征。比如，某Cre小鼠品系可能對某個靶基因位點的切割效率只有10%，但卻可對另外靶基因位點，達短100% 重組切割作用。

所以，實際應(yīng)用中需要注意的是，雖然報告小鼠能提供Cre表達作用的某些特征，但該小鼠對實際靶基因的特異性重組切割作用效果，必須根據(jù)其對某個特定基因的單個細胞水平上的實際作用效果進行評估。

3. 需要在特定的靶細胞/組織中鑒定Cre作用活性，以確保其作用的靶向特異性。
為了避免或降低某些Cre小鼠可能引起的明顯非特異性脫靶作用，在應(yīng)用Cre-loxP重組系統(tǒng)，進行靶基因編輯的實驗研究中，需要設(shè)計合理的PCR鑒定引物組合，目的在于分析鑒別靶基因重組打靶的不同情況，比如，基因的雜合敲除、純合敲除、未敲除，以及野生對照等可能的多種情況。

一般情況下，應(yīng)用小鼠尾巴DNA鑒定策略，進行所謂常規(guī)特異性基因型鑒定的時候，都不應(yīng)該檢測到靶基因被敲除的結(jié)果，除非該研究就是要特異性敲除皮膚上皮細胞的靶基因。這也是判斷Cre小鼠是否具有生殖細胞敲除作用的關(guān)鍵。借助如此簡單鑒定方法，能非�？焖俸Y選出那些無非特異性切割作用的Cre小鼠品系，以確保實驗研究的有效性與可靠性。而且，也可將靶細胞與對照細胞群，進行有效分離和檢測，以明確特異性基因敲除的效率。

判斷Cre小鼠是否具有生殖系作用活性的另外一個簡單方法，是將雙性別的Cre小鼠分別與相應(yīng)性別的報告基因小鼠交配，獲得的陽性后代小鼠（F1），再與野生小鼠交配，分析其后代小鼠（F2）的報告基因表達情況，如果此F2小鼠報告基因的表達較其F1更加明顯廣泛，提示該Cre小鼠可能具有生殖系作用活性。

在Cre-loxP重組系統(tǒng)實際應(yīng)用中，如果是以提高Cre重組切割作用效率為目的，可采用先建立將靶基因單等位基因，在生殖細胞中敲除小鼠，再與floxed條件性打靶小鼠繁殖的策略。但必須清楚該策略的局限性，即不適合那些靶基因雜合敲除有表型的情況。另外，也不適合需要敲除兩個基因以上的實驗研究。

Cre-loxP重組系統(tǒng)與其他重組系統(tǒng)聯(lián)合應(yīng)用，增加細胞譜系示蹤研究的特異性及有效性

細胞譜系示蹤的研究是借助Cre在特定靶細胞的激活，并通過相應(yīng)報告基因的表達來顯示。最為常見的報告基因為熒光蛋白，其表達的特異性與時空性完全依賴于特定Cre激活重組特性。因此，Cre/CreERT2小鼠與報告基因小鼠結(jié)合，常應(yīng)用于細胞譜系示蹤、行為學和鑲嵌組織中敲除細胞分布等方面研究。

為了改善細胞譜系示蹤準確性及有效性，重要的是如何準確有效標記示蹤特定細胞群及其后代中某類特殊細胞。如果報告基因在其他細胞群，發(fā)生非特異性表達，或者即使是正確的靶細胞群標記表達，但并非出現(xiàn)于研究所期望時間窗口期，都可能導(dǎo)致錯誤的實驗研究結(jié)果。

所謂Cre-loxP和Dre-rox雙重組系統(tǒng) , 即利用Cre和Dre雙重組酶識別各自特定loxP 和rox位點，比如，分別構(gòu)建靶基因（比如基因X和Y）相關(guān)的雙重組酶小鼠，即X-Dre和Y-CrexERT2兩種小鼠模型。而Y-CrexERT2小鼠的構(gòu)建，則是通過在CreERT2載體中ERT2序列兩端分別添加一個rox位點序列，從而構(gòu)建基因X和Y特異性啟動子介導(dǎo)的兩種Cre小鼠品系。應(yīng)用該雙重組系統(tǒng)，結(jié)合報告基因小鼠模型（比如R26-LSL-tdTomato), 實現(xiàn)特定細胞群譜系示蹤過程，滿足X-Dre和Y-CrexERT2同時表達陽性的限定范圍，使更加精準有效研究特定器官或組織特異性細胞譜系示蹤成為可能。

國內(nèi)中科院周斌課題組應(yīng)用該雙重組系統(tǒng)，成功實現(xiàn)了靶基因在冠狀動脈血管內(nèi)皮細胞（Tie2-Dre和Wt1-CrexERT2），或腦血管內(nèi)皮細胞（Tie-2和Mfsd2a-CrexERT2）的高效及特異性的基因敲除或過表達研究。

新型誘導(dǎo)性DD-cre小鼠模型的建立，成為未來Cre-loxP可誘導(dǎo)重組系統(tǒng)的補充

TAM誘導(dǎo)性Cre-ERT2小鼠應(yīng)用中的不足，比如，需要多次給藥，相對較慢的誘導(dǎo)激活與抑制過程；以及TAM可能與小鼠內(nèi)源性雌激素受體結(jié)合，導(dǎo)致相關(guān)副作用等，為進一步改善該系統(tǒng)，以及尋找更加有效誘導(dǎo)方法，具有其現(xiàn)實意義。最近新型誘導(dǎo)性DD-Cre小鼠模型研制應(yīng)用成功，也為Cre-loxP可誘導(dǎo)重組系統(tǒng)應(yīng)用，提供了額外的選擇。

DD技術(shù)的基本原理，是基于來自人的FKBP12或細菌二氫葉酸還原酶 (ecDHFR) 的突變去穩(wěn)定域（Destabilizing dormain-DD），與任何感興趣的蛋白（比如Cre) 融合而建立。而合成的含F(xiàn)KBP12或ecDHFR標記的新型DD-相關(guān)蛋白，可導(dǎo)致蛋白酶降解過程。但如此蛋白降解破壞通路，可被抗生素甲氧芐啶（Trimethoprim ，TMP）所阻斷。

DD-Cre小鼠模型是將DD域與Cre基因融合，構(gòu)建成去穩(wěn)定化Cre重組酶系統(tǒng) 的DD-Cre小鼠，且其重組活性由抗生素TMP誘導(dǎo)調(diào)控，即DD-Cre激活重組作用為TMP依賴，從而實現(xiàn)體內(nèi)Cre-loxP重組系統(tǒng)的位點特異性可誘導(dǎo)的靶基因編輯作用。

TMP誘導(dǎo)物價格便宜、無毒性、誘導(dǎo)快速、可通過胎盤及血腦屏障，且在哺乳動物體內(nèi)無內(nèi)源靶點存在等優(yōu)勢，使TMP成為穩(wěn)定DD標記蛋白的理想誘導(dǎo)物。因此，體內(nèi)應(yīng)用TMP誘發(fā)蛋白穩(wěn)定作用，有利于實驗動物誘導(dǎo)劑快速傳遞，發(fā)揮其在神經(jīng)系統(tǒng)等周圍組織的高效擴散效應(yīng)。

有研究借助R26-CAG-tdTomato或R26 Ai9-tdTomato報告小鼠，應(yīng)用不同濃度TMP（8～170 ug/g, 每天腹腔注射一次或連續(xù)七次) 誘導(dǎo)后24～48小時，其重組切割效果達高峰，且呈現(xiàn)劑量依賴效應(yīng)。研究表明，相對于CreERT2系統(tǒng)，TMP在體內(nèi)誘導(dǎo)效果快，使DD-Cre系統(tǒng)成為具有吸引力與理想的廣泛應(yīng)用于神經(jīng)遺傳研究領(lǐng)域的工具。

當然，如同其他方法一樣，DD-Cre技術(shù)也可能出現(xiàn)一定程度的Cre 背景活性。且活性作用也會受到某些因素的影響，比如，DD融合蛋白的降解率，穩(wěn)定性結(jié)合配體與合適亞細胞域融合的招募，以及DD表記對融合蛋白功能的干預(yù)等。

最后，將Cre-loxP 位點特異性重組系統(tǒng)應(yīng)用中，Cre小鼠構(gòu)建策略建議性指導(dǎo)原則及需要考慮的因素概括如下：