近日，中南大學(xué)湘雅醫(yī)院產(chǎn)科張衛(wèi)社教授、戴鐳博士后領(lǐng)導(dǎo)的產(chǎn)前診斷研究團(tuán)隊在美國腎病學(xué)學(xué)會官方期刊《Journal of the American Society of Nephrology》上發(fā)表了題為“A Biallelic Frameshift Mutation in Nephronectin Causes Bilateral Renal Agenesis in Humans”的文章，影響因子10.12，為國際上首次發(fā)現(xiàn)腎連蛋白（NPNT）基因是導(dǎo)致人類雙腎缺如的致病基因。戴鐳博士后為論文獨立第一作者，張衛(wèi)社教授為論文獨立通訊作者。
 

先天性腎尿路畸形是一種常見的出生缺陷，新生兒的發(fā)病率約為2/1000，在所有兒童先天性畸形中占30-40%。雙腎缺如（BRA）則是先天性腎尿路畸形中最嚴(yán)重的類型，通常會導(dǎo)致圍產(chǎn)期死亡或終止妊娠。盡管人們認(rèn)為遺傳因素扮演了重要角色，但仍有大部分病例的確切原因得不到診斷。

全外顯子組測序發(fā)現(xiàn)NPNT突變
在該研究中，一對近親夫妻連續(xù)三次妊娠都顯示雙腎未顯示、羊水過少，懷疑胎兒患有雙腎缺如而不得不引產(chǎn)，并通過引產(chǎn)胎兒的病理解剖得到證實。為了確定這背后的遺傳因素，研究人員對這個家庭中的多名成員開展全外顯子組測序（WES）（圖1）。
 

圖1. NPNT突變的家族譜系圖

研究人員發(fā)現(xiàn)在兩個異常胎兒共享了35.05 Mb的基因組區(qū)域，并從那些共有的連續(xù)性純合片段（ROH）中發(fā)現(xiàn)了310個變異。在去除了InterVar預(yù)測為良性和可能良性的變異后，剩下NPNT基因第8個外顯子中的純合移碼突變（c.777dup/p.Lys260*）。因此研究人員認(rèn)為，NPNT可能是導(dǎo)致雙腎缺如的第一候選基因。

腎連蛋白（Nephronectin，NPNT）對腎臟發(fā)育至關(guān)重要，小鼠中Npnt的敲除往往會導(dǎo)致腎缺如或發(fā)育不全。因此，NPNT被認(rèn)為是雙腎缺如的可能致病基因，但以往的研究NPNT突變并未在腎發(fā)育不全患者中報道。研究人員通過軟件預(yù)測，移碼突變可能導(dǎo)致下一個密碼子形成終止密碼子，從而產(chǎn)生截短蛋白，只有260個氨基酸。該預(yù)測通過體外過表達(dá)實驗得到了證實。

在過表達(dá)WT-NPNT和K260ter-NPNT的HEK293T細(xì)胞中，研究人員發(fā)現(xiàn)K260ter-NPNT mRNA表達(dá)水平顯著低于野生型對照。使用Flag標(biāo)簽抗體的Western blot分析在K260ter-NPNT轉(zhuǎn)染細(xì)胞中檢測到35 Kda的截短蛋白，且表達(dá)量降低，而針對突變下游表位的NPNT抗體則沒有檢測到截短蛋白，與預(yù)期一致（圖2）。這些結(jié)果證實，p.Lys260* 突變導(dǎo)致無義介導(dǎo)的mRNA降解和截短蛋白的產(chǎn)生。
 

圖2. WT-NPNT和K260ter-NPNT在293T細(xì)胞中的過表達(dá)

Npnt突變小鼠顯示腎發(fā)育不全
研究人員委托賽業(yè)生物，構(gòu)建了帶有Npnt-c.777dup/p.Lys260*突變的基因敲入小鼠，并通過雜合小鼠的交配產(chǎn)生純合突變體（NpntK260*/K260*）。利用Npnt抗體對純合小鼠的肺組織開展WB分析，未檢測到任何NPNT蛋白（圖3），表明引入小鼠模型的突變影響了Npnt蛋白的表達(dá)，與人類相似。
 

圖3. 模擬純合移碼突變的基因敲入小鼠的構(gòu)建

所有小鼠出生時都有著正常的外觀（大小、體重且無外部缺陷），但純合小鼠在出生后第二天死亡。研究人員解剖后發(fā)現(xiàn)，絕大多數(shù)純合小鼠的兩側(cè)都沒有腎臟（14/15），伴隨著輸尿管的缺失；剩下的一只NpntK260*/K260*小鼠有兩個尺寸較小的原始腎臟。組織學(xué)分析顯示，純合原始腎臟中的腎單位發(fā)育停滯，而其他組織沒有明顯的形態(tài)異常。

有意思的是，NpntK260*/K260*小鼠與Npnt−/−小鼠的表型存在一些差異。NpntK260*/K260*小鼠的雙腎缺如頻率高達(dá)93.3%，而以往報告的Npnt−/−小鼠頻率為46%。作者認(rèn)為，可能的原因在于另一種配體在功能上補(bǔ)償了Npnt−/−小鼠缺失的Npnt蛋白。在NpntK260*/K260*小鼠中，截短的Npnt蛋白殘基可能對替代配體產(chǎn)生負(fù)面影響。另一種可能的解釋是遺傳背景不同，近交系小鼠表現(xiàn)出較低的性狀可變性。

總結(jié)
這項研究表明，該患病家庭中出現(xiàn)的雙等位基因功能缺失NPNT突變是造成人類雙腎缺如的原因。模擬該突變的小鼠模型再現(xiàn)了雙腎缺如的臨床表型。這些結(jié)果揭示了雙腎缺如的新致病基因，為雙腎缺如家族的遺傳診斷、產(chǎn)前診斷和胚胎植入前診斷提供了新的靶點。

產(chǎn)科主任張衛(wèi)社教授領(lǐng)導(dǎo)的中南大學(xué)湘雅醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心經(jīng)四年建設(shè)，已成為中南地區(qū)技術(shù)力量最強(qiáng)、開展產(chǎn)前診斷項目最多的省級產(chǎn)前診斷中心之一。中心致力于復(fù)雜胎兒宮內(nèi)異常診治，罕見病的遺傳學(xué)診斷、產(chǎn)前診斷及科研工作，每年接待大量的疑難會診及轉(zhuǎn)診工作，為降低湖南省及周邊省市地區(qū)出生人口缺陷率，提高缺陷兒的救治率，挽救珍貴兒的生命起到了關(guān)鍵作用。

原文檢索：
Lei Dai, Jingzhi Li, Liangqun Xie, et al. A Biallelic Frameshift Mutation in Nephronectin Causes Bilateral Renal Agenesis in Humans. JASN August 2021, 32 (8) 1871-1879; DOI: https://doi.org/10.1681/ASN.2020121762

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