穩(wěn)定株篩選

研究某個基因的功能最常用的手段是在宿主細胞中過量表達或者通過RNA干擾的方法knock-down該基因,常規(guī)手段有瞬時轉(zhuǎn)染和篩選穩(wěn)定細胞系。

篩選出該基因的過表達或者RNA干擾的穩(wěn)定細胞系會給您的實驗帶來極大的便利。有了穩(wěn)定細胞系,后期的Co-IP或者Pull-Down實驗會非常便利;穩(wěn)定表達重組熒光蛋白的細胞系可以讓您動態(tài)的觀察分子在細胞中的運動。 構(gòu)建穩(wěn)定細胞系的基本原理是將外源DNA克隆到具有某種抗性的載體上,載體被轉(zhuǎn)染到宿主細胞并整合到宿主染色體中,用載體中所含的抗性標(biāo)志進行篩選。最常用的真核表達載體的抗性篩選標(biāo)志物有新霉素(neomycin)、潮霉素(hygromycin)和嘌呤霉素(puromycin),常用G418來代替新霉素進行選擇性篩選,篩選得到可穩(wěn)定表達目的蛋白,或者穩(wěn)定表達沉默特定基因的細胞株。

篩選穩(wěn)定細胞系的方法

1)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后,單克隆方法篩選穩(wěn)定細胞系

2)慢病毒感染篩選穩(wěn)定細胞系

慢病毒感染方法較質(zhì)粒轉(zhuǎn)染篩選單克隆方法更方便和高效,是目前主流的穩(wěn)定細胞系篩選方法。慢病毒幾乎可以感染所有種類的細胞,并且在感染后可以整合到受感染細胞的基因組,進行長時間的穩(wěn)定表達,因此,慢病毒常用于制備穩(wěn)定表達/沉默特定基因的單克隆細胞株。