本文要點(diǎn)：熒光團(tuán)聚集導(dǎo)致的發(fā)射猝滅效應(yīng)，長(zhǎng)期以來(lái)一直是優(yōu)化熒光成像和光電器件等發(fā)射技術(shù)的核心問(wèn)題。本研究揭示了二聚體在緩解稠環(huán)熒光團(tuán)4F的第二近紅外區(qū)（NIR-II, 900-1700 nm）發(fā)射猝滅中的關(guān)鍵作用，并基于此開發(fā)了高性能熒光成像技術(shù)。通過(guò)光譜解構(gòu)與分子動(dòng)力學(xué)模擬，證實(shí)了4F聚集體中二聚體的主導(dǎo)性。超快光譜和量子計(jì)算表明，二聚體的弱發(fā)射與強(qiáng)分子間非輻射（interNR）特征是4F聚集體發(fā)射猝滅的根源。因此通過(guò)減少二聚體比例，其NIR-II亮度達(dá)到吲哚菁綠的5倍，實(shí)現(xiàn)了血管成像的超高分辨率。該研究為聚集猝滅機(jī)制提供了關(guān)鍵見解，其影響遠(yuǎn)超出NIR-II熒光成像領(lǐng)域。

圖1. 熒光團(tuán)中NIR-II發(fā)射淬滅的示意圖

本研究揭示了二聚體在緩解熒光團(tuán)聚集體中NIR-II發(fā)射猝滅的本質(zhì)與核心作用（圖1）。通過(guò)設(shè)計(jì)疏水性稠環(huán)熒光團(tuán)（4F）并將其封裝于兩親性共聚物（Pluronic F-127）中，構(gòu)建了水溶性納米顆粒（4F NP1s），進(jìn)而調(diào)控聚集體研究NIR-II發(fā)射亮度的機(jī)制。光譜解構(gòu)與分子動(dòng)力學(xué)計(jì)算表明，4F NP1s中二聚體與單體均參與NIR-II發(fā)射，且二聚體比例顯著高于單體。飛秒瞬態(tài)吸收（fs-TA）實(shí)驗(yàn)與量子化學(xué)計(jì)算進(jìn)一步揭示，相較于高發(fā)射性的單體，二聚體呈現(xiàn)弱發(fā)射特性且具有高效的分子間非輻射（interNR）衰變路徑。由此，二聚體的主導(dǎo)性及其弱發(fā)射-強(qiáng)interNR特性共同導(dǎo)致了4F NP1s的聚集猝滅（ACQ）現(xiàn)象�；�于此，通過(guò)簡(jiǎn)易的聚集調(diào)控策略減少二聚體比例，成功制備出超亮4F聚集體（4F NP3s），其亮度達(dá)7.1×10³ M⁻¹ cm⁻¹，是吲哚菁綠（ICG，1560 M⁻¹ cm⁻¹）的5倍，創(chuàng)NIR-II熒光亮度新高。這一特性使4F NP3s在血管成像中展現(xiàn)出超高分辨率。

圖2. 4F 在單分子和聚集狀態(tài)下的光學(xué)特性

在四氫呋喃（THF）溶液中，4F展現(xiàn)出強(qiáng)近紅外吸收（ε₈₀₈ nm = 6.4×10⁴ M⁻1 cm⁻1，圖2a）與高強(qiáng)度NIR-II發(fā)射，其光致發(fā)光量子產(chǎn)率（ΦPL）高達(dá)17.1%（參比物：IR-26，ΦPL=0.5%，圖2b），性能超越多數(shù)已報(bào)道的NIR-II熒光團(tuán)。這種長(zhǎng)波長(zhǎng)吸收/發(fā)射特性源于4F完全平面骨架中的大范圍π共軛效應(yīng)：其在基態(tài)（S₀）與激發(fā)態(tài)（S₁）的扭轉(zhuǎn)角均極�。�<0.4°，圖2c）。相互作用區(qū)域指示分析表明，4F的平面構(gòu)象由分子內(nèi)非共價(jià)S···O構(gòu)象鎖穩(wěn)定（圖2c）。值得注意的是，這種獨(dú)特構(gòu)象鎖不僅支撐了長(zhǎng)波長(zhǎng)吸收/發(fā)射所需的平面結(jié)構(gòu)，還增強(qiáng)了分子剛性，顯著抑制分子運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致的非輻射能量耗散。

為適應(yīng)生物應(yīng)用，將疏水性4F（1 mg/mL）封裝至Pluronic F-127中，制備出水溶性納米顆粒（4F NP1s）。動(dòng)態(tài)光散射（DLS）和透射電子顯微鏡（TEM）證實(shí)，所得納米顆粒均一性良好，流體力學(xué)直徑為50 nm。相較于THF中的單分子4F，4F NP1s的最大吸收峰出現(xiàn)顯著紅移，且在808 nm處的摩爾吸光系數(shù)（ε）提升至6.8×10⁴ M⁻1 cm⁻1（圖2a）。這一紅移使其吸收更接近800 nm左右的生物組織透明窗口波長(zhǎng)，增強(qiáng)了其在深部組織生物應(yīng)用中的潛力。然而，4F NP1s的熒光性能顯著下降，其光致發(fā)光量子產(chǎn)率（ΦPL）從17.1%驟降至2.6%（圖2b）。相應(yīng)地，4F NP1s的熒光亮度相較于THF中的單分子4F降低了一個(gè)數(shù)量級(jí)（1.79×10³ M⁻1 cm⁻1¹ vs. 1.09×10⁴ M⁻1 cm⁻1），極大限制了其生物成像應(yīng)用價(jià)值。

當(dāng)fw增至20%時(shí)，4F在約850 nm處出現(xiàn)新的紅移吸收峰，并在1050 nm附近產(chǎn)生PL峰，與4F NP1s（聚集態(tài)）的光譜特征高度吻合。隨著fw繼續(xù)增加，1050 nm處的聚集態(tài)發(fā)射峰顯著增強(qiáng)，而4F整體PL強(qiáng)度逐漸降低（圖2d）。分子動(dòng)力學(xué)模擬證實(shí)，體系中存在多種二聚體構(gòu)型與單體共存（圖2e、f）。因此，將850 nm處的長(zhǎng)波長(zhǎng)吸收峰與1050 nm處的發(fā)射峰歸因于二聚體。光譜解構(gòu)進(jìn)一步揭示4F NP1s的雙組分熒光特性（圖2h），其發(fā)射峰分別對(duì)應(yīng)單體（~940 nm）和二聚體（~1050 nm）。值得注意的是，4F NP1s中二聚體占比顯著高于單體（64.3% vs. 35.7%），表明二聚體在體系中占主導(dǎo)地位（圖2h）。此外，量子化學(xué)計(jì)算表明，二聚體的振子強(qiáng)度小于單體，預(yù)示其發(fā)射能力較弱。同時(shí)，納米顆粒內(nèi)二聚體分子間距僅約3Å（圖2f），強(qiáng)烈的π-π相互作用進(jìn)一步加劇了非輻射衰變。綜上，4F聚集態(tài)熒光減弱的主要原因是體系中占主導(dǎo)的低發(fā)射性二聚體種群。

圖3. 通過(guò)減少二聚體數(shù)量顯著緩解發(fā)射猝滅

接著，研究者通過(guò)調(diào)控F-127溶液中4F的摻雜濃度，實(shí)現(xiàn)對(duì)聚集體內(nèi)二聚體種群的精準(zhǔn)調(diào)節(jié)。相較于高濃度（4F: 1 mg/mL）的4F NP1s，低濃度摻雜的4F NP2s（4F: 0.1 mg/mL）和4F NP3s（4F: 0.01 mg/mL）的流體力學(xué)直徑略有減小，分別為40 nm和30 nm。長(zhǎng)期儲(chǔ)存的4F NPs熒光強(qiáng)度和光譜形態(tài)均無(wú)明顯變化，光學(xué)性能穩(wěn)定。上述結(jié)果共同表明4F NPs具有卓越的穩(wěn)定性。4F NP2s的吸收光譜與4F NP1s相似，分別在760 nm和840 nm處呈現(xiàn)單體和二聚體的特征吸收峰（圖3a）。相比之下，4F NP3s的840 nm處二聚體吸收峰和1050 nm處發(fā)射峰均顯著減弱（圖3a, b）。光譜解構(gòu)顯示，4F NP3s中二聚體占比從73.5%降至64.3%（圖3a），隨著4F濃度降低，二聚體比例減少。

正如預(yù)期，4F NP2s和4F NP3s的熒光量子產(chǎn)率（ΦPL）顯著提升，分別從4F NP1s的2.6%增至2.9%和7.5%（圖3c）。此外，隨著聚集程度降低，其在808 nm處的摩爾吸光系數(shù)（ε）也從6.8×10⁴ M⁻1 cm⁻1逐步提升至7.2×10⁴和9.5×10⁴ M⁻1 cm⁻1，其中4F NP3s的ε808nm甚至高于單分子態(tài)4F（ε808nm=6.4×10⁴ M⁻1 cm⁻1）。綜合來(lái)看，4F NP3s的熒光亮度高達(dá)7.1×10³ M⁻1 cm⁻1（圖3c），幾乎與THF中單分子態(tài)4F的亮度（10.9×10³ M⁻1 cm⁻1）相當(dāng)，且是4F NP1s（1.8×10³ M⁻1 cm⁻1）的4倍。值得注意的是，4F NP3s的亮度還比吲哚菁綠（ICG，1560 M⁻1 cm⁻1）高出約5倍，達(dá)到NIR-II熒光亮度的頂級(jí)水平。這些現(xiàn)象表明，通過(guò)調(diào)控二聚體比例可有效緩解聚集導(dǎo)致熒光猝滅（ACQ），從而顯著提升4F聚集體的NIR-II亮度。

進(jìn)一步通過(guò)超快光譜分析，深入理解了4F NP3s的ΦPL提升機(jī)制�；鶓B(tài)漂白（GSB）區(qū)域的動(dòng)力學(xué)曲線顯示，4F NP2s和4F NP3s的非輻射衰變（interNR）速率減緩，其時(shí)間常數(shù)從0.49 ps延長(zhǎng)至0.98 ps（圖3d）。同時(shí)，二聚體發(fā)射壽命從9.4 ps延長(zhǎng)至11.6 ps。飛秒瞬態(tài)熒光光譜測(cè)得4F NP3s的熒光壽命為435 ps（圖3e），與飛秒瞬態(tài)吸收（fs-TA）在GSB區(qū)域提取的長(zhǎng)壽命組分（496 ps）高度吻合。因此，4F NP2s（227 ps）、4F NP1s（179 ps）和單分子態(tài)4F（134 ps）的時(shí)間常數(shù)被合理歸因于單體熒光。遺憾的是，受限于檢測(cè)靈敏度（~300 ps），無(wú)法通過(guò)飛秒瞬態(tài)熒光光譜測(cè)得4F NP2s、4F NP1s及單分子態(tài)4F的熒光壽命。綜上，這些結(jié)果證實(shí)了二聚體在調(diào)控4F聚集體NIR-II亮度中的核心作用：增大分子間距的二聚體不僅能保留強(qiáng)效的長(zhǎng)波長(zhǎng)吸收，還可緩解長(zhǎng)期存在的ACQ問(wèn)題，為設(shè)計(jì)超越NIR-II成像應(yīng)用的更高亮度熒光團(tuán)提供了重要指導(dǎo)。

圖4. 體內(nèi)高性能NIR-II熒光成像

4F NP3s的卓越亮度展現(xiàn)了其在活體NIR-II熒光成像中的巨大潛力。對(duì)4F NP3s的NIR-II熒光成像性能進(jìn)行評(píng)估，并與臨床認(rèn)可的造影劑吲哚菁綠（ICG）進(jìn)行對(duì)比。將4F NP3s或ICG溶液（200 μL，1 mg/mL）通過(guò)尾靜脈注射至小鼠體內(nèi)后，使用配備不同長(zhǎng)通濾光片（1000、1300及1500 nm）的InGaAs探測(cè)器進(jìn)行全身血管造影（圖4a）。成像結(jié)果顯示，4F NP3s的空間分辨率顯著優(yōu)于ICG。值得注意的是，在NIR-IIb窗口（1500 nm長(zhǎng)通）下，4F NP3s能清晰顯示血管結(jié)構(gòu)且背景噪聲顯著降低，與常規(guī)NIR-II區(qū)域（980和1300 nm長(zhǎng)通）的模糊血管相比，展現(xiàn)出卓越的成像對(duì)比度。通過(guò)后肢血管的高倍放大成像，980、1300及1500 nm長(zhǎng)通濾光片對(duì)應(yīng)的血管半峰寬（FWHM）分別為0.49、0.30和0.25 mm（圖4b），證實(shí)NIR-IIb成像具有更高分辨率。同時(shí)，NIR-IIb區(qū)域的信背比（SBR）高達(dá)4.04，遠(yuǎn)超980 nm（1.71）和1300 nm（2.75）長(zhǎng)通濾光片的SBR。更重要的是，NIR-IIb窗口下可清晰分辨腹部血管周圍的分支小血管，而常規(guī)NIR-II窗口則無(wú)法獲得清晰圖像（圖4a）。這些結(jié)果表明，4F NP3s在活體內(nèi)實(shí)現(xiàn)了高性能熒光成像，并具有優(yōu)越的信背比。

4F NP3s在骨肉瘤荷瘤BALB/c裸鼠模型中進(jìn)一步展現(xiàn)了其在深部腫瘤成像中的潛力。如圖4c所示，注射后6小時(shí)即可在腫瘤部位觀察到顯著的NIR-II熒光信號(hào)，且信號(hào)強(qiáng)度隨時(shí)間逐漸增強(qiáng)，于24小時(shí)達(dá)到峰值。這表明4F NP3s能夠通過(guò)增強(qiáng)滲透滯留（EPR）效應(yīng)實(shí)現(xiàn)深部穿透成像，并在腫瘤區(qū)域有效富集。即使注射后36小時(shí)，腫瘤部位熒光信號(hào)雖有所減弱，但仍保持良好亮度，凸顯了4F NP3s作為深部腫瘤導(dǎo)航探針的長(zhǎng)期NIR-II熒光成像潛力（圖4d）。4F NP3s展現(xiàn)出高分辨率的NIR-IIb血管成像性能，并作為腫瘤導(dǎo)航對(duì)比劑在光熱診療應(yīng)用中具有卓越潛力。

本研究提出并驗(yàn)證了以弱發(fā)射和強(qiáng)烈的NR間衰減為特征的占主導(dǎo)地位的二聚體群體是在 4F 聚集體中觀察到的 ACQ 的基礎(chǔ)。這標(biāo)志著在解決 ACQ 長(zhǎng)期挑戰(zhàn)方面取得了重大進(jìn)展。這種方法的成功引入了一種創(chuàng)新策略，即使在聚集狀態(tài)下也能開發(fā)超亮有機(jī)π共軛材料。總之，這項(xiàng)研究不僅為克服 ACQ效應(yīng)提供了新的見解，也為創(chuàng)建高效和穩(wěn)定的 NIR-II 熒光團(tuán)鋪平了道路。

參考文獻(xiàn)

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