基于近紅外光激發(fā)的多光子吸收效應的多光子熒光成像以特有的深穿透、高時空分辨、高信噪比和低毒性等優(yōu)點，在生物成像，尤其是在活體深層組織成像中被廣泛應用。相比傳統(tǒng)單光子生物成像中使用的紫外可見光光源，近紅外光的引入極大地提高了多光子熒光成像的穿透深度。近些年來，位于近紅外二區(qū)的光源由于在生物組織中具有更小散射和更大的穿透能力，在單光子和多光子熒光成像中均受到廣泛關注和研究，進一步提高了生物成像的深度。

研究背景與技術挑戰(zhàn)
傳統(tǒng)熒光顯微成像的局限
熒光顯微技術自誕生以來，一直是生物醫(yī)學研究的核心工具。通過熒光染料標記，科學家得以觀察細胞和亞細胞結構的動態(tài)。然而，傳統(tǒng)單光子熒光成像依賴紫外或可見光作為激發(fā)光源，這些波段的光極易被生物組織中的血紅蛋白、黑色素等分子吸收，導致穿透深度不足。即便采用最先進的物鏡和探測技術，共聚焦顯微鏡在活體深層組織成像中仍力不從心。這種局限性嚴重制約了腦科學、腫瘤學等領域對活體動態(tài)過程的研究需求。

近紅外二區(qū)的優(yōu)勢與挑戰(zhàn)
近紅外光在生物組織成像中具有獨特的優(yōu)勢，根據(jù)其在組織中的傳播特性，可分為近紅外一區(qū)（NIR-Ⅰ，700-950nm）和近紅外二區(qū)（NIR-Ⅱ，1000-1700nm）。近紅外二區(qū)的光在生物組織中具有更小的散射和更大的穿透能力，是更優(yōu)的“組織光學窗口”，其衰減長度比近紅外一區(qū)更長，在多光子熒光成像中能夠實現(xiàn)更深的成像深度。目前近紅外二區(qū)激發(fā)的多光子熒光成像技術仍面臨諸多挑戰(zhàn)�，F(xiàn)有的具有紅光吸收的染料在近紅外二區(qū)的多光子吸收能力（吸收截面）相對較小，熒光量子產率也較低。此外，許多熒光染料的三光子吸收截面過小，激發(fā)效率低，需要更高的激發(fā)功率，這又可能導致生物組織的熱損傷，在神經元成像中尤為明顯。

技術創(chuàng)新與應用
成像原理的革新
多光子熒光成像基于熒光染料分子吸收多個近紅外光子后被激發(fā)并發(fā)射熒光的原理。在單光子熒光成像中，一個熒光染料分子吸收一個光子從基態(tài)激發(fā)到激發(fā)態(tài)，再通過內部轉換回到基態(tài)并發(fā)射熒光，發(fā)射光波長大于激發(fā)光。而在多光子激發(fā)中，染料分子在短時間內吸收兩個或三個光子，吸收的光子能量之和接近單光子激發(fā)所需能量時，分子也會被激發(fā)發(fā)射熒光。由于能量關系，多光子激發(fā)的光波段紅移至近紅外波段。

多光子激發(fā)是一個非線性過程，雙光子吸收激發(fā)出的熒光強度與激發(fā)光強度的二次方成正比，三光子吸收則與三次方成正比，這種特性使得多光子熒光成像僅在聚焦點處產生熒光，克服了離焦信號的干擾，具備了三維層析成像能力，這是與單光子熒光成像的主要區(qū)別之一。

多領域前沿應用
在腦科學研究中，該技術可用于大深度腦血管網絡成像和腦神經成像。在腦血管網絡成像方面，研究人員利用近紅外二區(qū)光源激發(fā)，成功實現(xiàn)了對小鼠深層腦區(qū)微細血管結構的清晰成像。在腦神經成像中，多光子熒光成像技術憑借其細胞級分辨率和活體深腦區(qū)三維成像能力，被廣泛應用于活體腦神經元的形貌和活動監(jiān)測。此外，研究人員還通過優(yōu)化成像系統(tǒng)的光學參數(shù)，實現(xiàn)了對深腦區(qū)的亞細胞分辨神經功能成像，為腦科學研究提供了有力的技術支持。

在經顱成像研究中，傳統(tǒng)的成像在進行腦成像時，需要去除或打磨顱骨，這會對生物組織造成侵入性影響。而近紅外二區(qū)光源穿透能力更強，有望實現(xiàn)無損的經顱腦成像。Wang團隊證明：1320 nm三光子激發(fā)可穿透完整顱骨，對皮層下的神經元進行無損成像，還實現(xiàn)了對小鼠腦皮層血管網絡的經顱三光子熒光成像，并測試了血流速度，可進一步提高穿透能力和成像深度。

在腫瘤和心血管疾病研究中，多光子成像技術也發(fā)揮著重要作用。在腫瘤研究方面，通過標記腫瘤血管或利用腫瘤組織與正常組織內源性熒光團的差異，可實現(xiàn)對腫瘤的高分辨成像。在心血管疾病研究中，脂質在代謝類疾病中扮演著重要角色，但目前在動物活體水平研究脂質的動態(tài)發(fā)展面臨挑戰(zhàn)。

成像實驗與結果分析
腦血管成像
以Kobat等人的實驗為例，成功實現(xiàn)了1.6mm深度的小鼠腦活體血管網絡雙光子熒光成像。在成像過程中，為保證圖像信噪比，在腦皮層0.7mm深度以上區(qū)域，激發(fā)光功率隨成像深度增加而逐漸增加。這一實驗成果證實了近紅外二區(qū)光源在深層腦結構多光子熒光成像中的巨大優(yōu)勢。

Horton等人的實驗實現(xiàn)了三光子熒光腦成像，成像深度達到1300μm。在成像深度800μm以上區(qū)域，每幀圖像采集時間約為8s，超過800μm后將激光器功率開到最大，采集時間增加至20s。從實驗結果來看，在深度超過1000μm甚至達到1300μm時，腦血管的三光子熒光信號依然能夠被采集到并形成圖像，在1000-1135μm的腦區(qū)，三光子熒光圖像的信噪比為79-119。

Liu等人實現(xiàn)了深度達2100μm的腦血管網絡三光子成像。量子點具有穩(wěn)定、熒光光譜窄且明亮的特點，在成像過程中，大深度高速的三光子熒光成像在1700nm激發(fā)下能夠實現(xiàn)高效的三光子熒光發(fā)射。

腦神經成像
Ouzounov等人實現(xiàn)了海馬區(qū)超過1mm深度的神經元三光子熒光成像。實驗結果以高信噪比的三光子熒光圖清晰地揭示了在距離大腦表面約1mm位置處的海馬區(qū)錐體層的神經元的典型蜂窩狀排列，同時以8.49Hz的頻率記錄了約150個神經元的活動，長達48min。

Horton等人實現(xiàn)了三光子熒光成像。這一實驗結果表明，雖然1700nm激發(fā)下熒光信號較弱，但通過調整積分時間等參數(shù)，仍可實現(xiàn)較深的成像深度。Miller等人在整個成像過程中，不同腦區(qū)深度采用平均多張圖像的方式來保證成像信噪比，隨著成像深度增加，熒光蛋白標記的神經元信號逐漸減弱，需要增加成像幀數(shù)或提高積分時間，這在一定程度上降低了成像速度。

Wang等人實現(xiàn)了對小鼠顱骨內骨細胞的三次諧波成像，探測到的顱骨厚度為140μm，顱骨下大腦皮層150μm內的血管和神經元樹突也被激發(fā)出較強的三次諧波信號。同時，利用染料對顱骨染色后，對顱骨內骨細胞的三次諧波和三光子熒光成像揭示了“三明治”式的結構特征，表明近紅外二區(qū)光源在腦顱骨中具有較好的穿透能力。

在心血管疾病方面，Wang等人在1200nm激發(fā)下，三光子熒光成像實現(xiàn)大深度活體脂質成像，相比雙光子成像，信噪比和成像深度更優(yōu)，證明活體標記脂質的可行性及三光子熒光成像在監(jiān)測疾病發(fā)展中的優(yōu)勢。

總結與展望
在腦科學、腫瘤和心血管疾病研究中提供了關鍵的成像數(shù)據(jù)，助力深入探究疾病機制，為診斷和治療奠定基礎。但目前該技術存在熒光染料性能欠佳、激發(fā)效率低等問題。為此，科研人員正積極研發(fā)新型熒光染料，改進激發(fā)光源和成像系統(tǒng)。未來，該技術有望大幅提升成像質量，實現(xiàn)雙光子與三光子成像的優(yōu)勢互補，還將與人工智能、光聲成像等前沿技術融合，拓展應用邊界。

論文信息
聲明：本文僅用作學術目的。

王少偉, 雷銘. 近紅外二區(qū)激發(fā)多光子熒光成像[J]. 激光與光電子學進展, 2022, 59(6): 0617002.

DOI:10.3788/LOP202259.0617002.