南京大學醫(yī)學院附屬口腔醫(yī)院閆福華教授團隊的劉佳盈、陳斌等人的研究成果"Macrophage polarization in periodontal ligament stem cells enhanced periodontal regeneration"在學術期刊 STEM CELL RESEARCH & THERAPY上成功發(fā)表，海斯菲德公司的Micro CT產(chǎn)品（產(chǎn)品型號：Hiscan XM）在論文中提供了重要的大鼠牙槽骨顯微CT重建圖像。

 

目的：探究在基于牙周膜干細胞（PDLSC）的牙周再生過程中巨噬細胞是否以及如何參與PDLSC再生過程中的組織穩(wěn)態(tài)和創(chuàng)面愈合。

實驗方法：利用大鼠牙周缺損模型觀察PDLSC移植增強牙周修復過程中的再生過程。分別于術后第3、7和21天觀察M1 / M2巨噬細胞標志物的動態(tài)變化，并在第21天分析再生的結果。此外，作者為了進一步研究PDLSCs對巨噬細胞極化的影響，使用PDLSCs的條件培養(yǎng)基處理M0，M1和M2巨噬細胞24小時后同時在巨噬細胞中評估了M1 / M2極化標記。

結果：在第21天，Micro-CT掃描結果顯示在PDLSC治療組中的骨體積和骨小梁的平均厚度增加。同時，經(jīng)PDLSC治療的牙周再生增強，同時伴有明顯的膠原纖維形成。此外作者還發(fā)現(xiàn)PDLSC培養(yǎng)可通過下調(diào)TNF-α并上調(diào)IL-10，Arg-1和CD163誘導巨噬細胞向抗炎表型極化。

結論：PDLSCs可以誘導巨噬細胞向M2型表型極化，并且在組織修復的早期極化向M2巨噬細胞的轉(zhuǎn)變有助于干細胞移植后牙周再生的增強。因此，來自移植的PDLSC的信號可能會改變免疫微環(huán)境，從而增強牙周再生。

 

作者選用了5周齡雄性 Sprague-Dawley (SD)大鼠的第一、二磨牙進行 PDLSC 分離、培養(yǎng)和鑒定。

實驗選用了SD大鼠的股骨和脛骨用于分離BMDM。培養(yǎng)分離的細胞時使用補充了10％的FBS，1％的P/S和40 ng/ml巨噬細胞集落刺激因子的DMEM（M-CSF,PeproTech, USA）。在培養(yǎng)開始7天后，用50 ng / ml脂多糖（LPS，Sigma-Aldrich）和30 ng / ml干擾素-γ（IFN-γ, PeproTech, USA）或20 ng / ml 的白細胞介素4刺激BMDM24小時。7天后用50％的PDLSC-CM替換條件組的培養(yǎng)基而對于測試組使用50%的新鮮培養(yǎng)基替換并培養(yǎng)24h。

實驗選用了7周齡SD大鼠共42只，隨機分為以下3組：空白組，膠原膜組和PDLSCs膠原膜組。對于PDLSCs膠原膜組，在膠原膜(Bio-Gide®, Geistlich, Switzerland)上添加20ul 的PDLSCs懸浮液（10^6 cell/ml）。在大鼠的右側口腔面皮膚上作前后方向的切口，進入下頜骨，并使用牙鉆和大量的鹽水使得第一和第二磨牙的牙根暴露形成大約5mm×1.5 mm×0.8 mm的缺損。術后3天和7天，每組隨機處死4只。術后21天，每組隨機處死6只，取下右下頜骨并用4%多聚甲醛固定以便下一步治療。

 

作者通過將帶有異體PDLSCs的膜材料移植到老鼠的牙周缺損處(圖2 A, C)并在手術后的21天通過顯微ct重建對實驗組進行觀察發(fā)現(xiàn)，使用PDLSC治療組有相對更為連續(xù)的骨再生現(xiàn)象(圖2 b)。作者還發(fā)現(xiàn)，使用PDLSC治療后的小鼠的骨體積和平均骨小梁厚度(TbTh)有顯著增加(圖2 D, E)。同時組織學切片的HE和Masson染色可以進一步觀察到PDLSC組的新生骨幾乎完全覆蓋了牙周缺損(圖2 H)。可以證明牙周再生的關鍵表現(xiàn)為膠原纖維走向良好并且在牙本質(zhì)表面有類牙骨質(zhì)物體生成。而在其他兩組中未觀察到相似結構。因此作者認為牙骨質(zhì)再生可能與移植的PDLSCs有關。

 

 

作者在細胞因子分泌和巨噬細胞極化方面檢查了PDLSCs是否可能通過牙周愈合影響炎癥環(huán)境。實驗結果顯示手術后3天，與其他兩組相比，PDLSC組的IL-10水平較高而TNF-α分泌水平較低（圖3 A, B)，并且在未來的第7天和第21天TNF-α的水平一直在所有實驗組中處于最低水平（圖3C-F）。而對于IL-10分泌水平，從3-21天開始PDLSC組逐漸趨于穩(wěn)定，同時在空白和膜組中IL-10分泌水平一直在增加。因此，在愈合的后期，PDLSC組中的IL-10在第21天時低于其他組（圖3A-F）。因此就總體而言，它在體內(nèi)發(fā)揮了抗炎功能。

 

 

作者進一步研究了PDLSC對體外巨噬細胞亞群的影響。圖4A顯示被LPS和IFN-γ刺激的巨噬細胞呈扁平圓形，而用IL-4處理的巨噬細胞則較長。通過圖4B和C可以觀察到M(LPS+IFN-γ)表達了高水平的iNOS、TNF-α和低水平的Arg-1。相反，經(jīng)IL-4處理的巨噬細胞表現(xiàn)出高水平的Arg-1和低水平的iNOS、TNF-α，這與未活化的巨噬細胞相似。該結果與 LPS +IFN-γ或IL-4等不同刺激處理的巨噬細胞的特征與相關研究的報道一致。

 

 

作者為了研究PDLSC對巨噬細胞的影響，使用PDLSC條件培養(yǎng)基治療未活化和極化的巨噬細胞。實驗檢測到M2或抗炎巨噬細胞的表面標記物CD163。圖5AB顯示經(jīng)過PDLSC-CM處理24小時后，未激活的巨噬細胞和M（IL-4）的CD163 +巨噬細胞比例均增加。圖5CD顯示通過PDLSC條件培養(yǎng)基培養(yǎng)后，CD163+巨噬細胞比例在48小時有明顯增長。然而，在PDLSC-CM處理24小時或48小時后，未發(fā)現(xiàn)M上CD163表達的顯著變化（LPS +IFN-γ）。因此結果表明，PDLSC通過其旁分泌產(chǎn)物誘導CD163在非活化和抗炎巨噬細胞中的表達，而對促炎巨噬細胞沒有顯著影響。

 

 

作者為了進一步探索PDLSC對巨噬細胞的作用，定量了TNF-α，IL-10，Arg-1和iNOS的基因轉(zhuǎn)錄。如圖6所示PDLSC-CM降低了TNF-αmRNA轉(zhuǎn)錄，同時增加M（-）和M（IL-4）中的IL-10，Arg-1和iNOS轉(zhuǎn)錄。PDLSC-CM增加了M（LPS +IFN-γ）中iNOS的轉(zhuǎn)錄，但沒有改變TNF-α，IL-10和Arg-1轉(zhuǎn)錄。如此表明，來自PDLSCs的旁分泌產(chǎn)物通過下調(diào)TNF-α并上調(diào)IL-10和Arg-1對未活化和消炎的巨噬細胞發(fā)揮抗炎作用。

 

 

綜上所述，作者的研究表明 PDLSC 移植可能通過影響巨噬細胞向 M2 亞型的極化而促進再生。但是PDLSCs 對巨噬細胞極化的作用機制及其對牙周微環(huán)境的免疫調(diào)節(jié)仍需要進一步研究。牙周創(chuàng)面愈合是一個復雜的過程，涉及多種分子和細胞類型相互作用，在局部環(huán)境中完成再生過程。此論文對有關該流程的信息研究有限，指出了可能參與該流程的幾個相關成分，巨噬細胞對牙周再生的直接作用以及背后的機制仍需要進一步的研究來證實�；�于免疫干預結合 PDLSCs 或其產(chǎn)品的新方法在牙周再生中的療效有待研究。

 

Hiscan XM Micro-CT System是一款集離體掃描和活體掃描于一體的Micro-CT。最高分辨率可達4µm。最大掃描范圍可達到75mmx210mm(多次掃描)。可做小動物全身掃描，如小鼠、大鼠等；也可以掃描所選擇的感興趣區(qū)域，例如小鼠和大鼠的頭部、脊椎、前肢、后肢等；還可以掃描離體樣本材料，如小鼠或大鼠的股骨、脛骨、顱骨、牙齒、四肢，生物支架材料，電子元器件，建筑材料，植物土壤，植物種子，昆蟲等各種需要掃描其內(nèi)部結構的材料。

 

 

[1] Liu, Jiaying & Chen, Bin & Bao, Jun & Zhang, Yangheng & Lei, Lang & Yan, Fuhua. (2019). Macrophage polarization in periodontal ligament stem cells enhanced periodontal regeneration. Stem Cell Research & Therapy. 10. 320. 10.1186/s13287-019-1409-4.