基于CRISPR/cas9的基因編輯工具的發(fā)展歷史

（圖片來(lái)自“Application of the CRISPR/Cas9-based gene editing technique in basic research, diagnosis, and therapy of cancer”.）

無(wú)論是重大疾病的治療，還是農(nóng)作物超級(jí)品種的培育，都是關(guān)乎人類(lèi)社會(huì)未來(lái)發(fā)展的重要命題。
 

一、CRISPR/Cas系統(tǒng)在癌癥研究中的應(yīng)用
癌癥的起始和進(jìn)展涉及一系列基因的突變和異常表達(dá)，包括致癌基因、腫瘤抑制基因、化療耐藥基因、代謝相關(guān)基因和癌癥干細(xì)胞相關(guān)基因。癌癥治療的最終目標(biāo)是通過(guò)特異性糾正突變和恢復(fù)失調(diào)基因的表達(dá)來(lái)抑制腫瘤的生長(zhǎng)和進(jìn)展。在過(guò)去的20年里，高通量測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)了大量與癌癥起始和進(jìn)展相關(guān)的基因。基于這些進(jìn)展，基因編輯技術(shù)有望通過(guò)調(diào)節(jié)基因表達(dá)和糾正基因突變來(lái)治療癌癥，這可能會(huì)導(dǎo)致精準(zhǔn)腫瘤領(lǐng)域的進(jìn)一步突破。
  早期診斷
CRISPR/Cas9在癌癥診斷中的應(yīng)用
——通過(guò)基因診斷來(lái)識(shí)別敏感基因是預(yù)防癌癥的關(guān)鍵。

研究團(tuán)隊(duì)利用CRISPR/Cas9敲除致癌突變EGFR等位基因，發(fā)現(xiàn)肺癌細(xì)胞系H1975、A549和H1650的生長(zhǎng)和增殖被抑制，植入H1975或A549細(xì)胞的異種移植小鼠腫瘤尺寸減小。
 

  靶向治療

研究表明，CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)是識(shí)別癌基因和評(píng)估癌基因靶向治療潛力的有效工具。

激活抑制基因

修復(fù)失活的腫瘤抑制基因——識(shí)別并激活抑癌基因，抑制癌變通道

該研究團(tuán)隊(duì)使用CRISPR/dCas9與反式激活因子VP64-p65-Rta(VPR)聯(lián)合使用，激活低水平PTEN表達(dá)的癌細(xì)胞中PTEN的表達(dá)。結(jié)果顯示，dCas9-VPR系統(tǒng)提高了黑色素瘤和TNBC細(xì)胞系中PTEN的表達(dá)水平，而PTEN的激活明顯抑制了下游的致癌通路。

  調(diào)節(jié)癌細(xì)胞耐藥性
解決癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥性問(wèn)題
——識(shí)別化療耐藥相關(guān)基因并調(diào)節(jié)其表達(dá)水平或功能

CRISPR/Cas9在NSCLC細(xì)胞系中敲除AURKB，也恢復(fù)了腫瘤抑制基因TP53的表達(dá)以及對(duì)順鉑和紫杉醇（兩種化療藥物）的敏感性。
  
  了解代謝機(jī)制
關(guān)于代謝基因——腫瘤細(xì)胞依賴于足夠的能量供應(yīng)來(lái)支持增殖、遷移和侵襲，了解能量代謝機(jī)制可能為我們?cè)诎┌Y治療中靶向能量產(chǎn)生途徑提供新的思路。

采用CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除HEp-2細(xì)胞中的HIF-1α和GLUT−1基因，導(dǎo)致增殖、遷移和侵襲減少。Tey發(fā)現(xiàn)，HIF-1α和GLUT-1基因敲除可顯著降低HEp-2細(xì)胞的葡萄糖攝取和乳酸。

  腫瘤干細(xì)胞相關(guān)基因
腫瘤干細(xì)胞(CSC)是腫瘤中自我更新的細(xì)胞，可以產(chǎn)生異質(zhì)性腫瘤細(xì)胞，在癌癥的發(fā)生、進(jìn)展、復(fù)發(fā)和治療耐藥性中發(fā)揮關(guān)鍵作用。由于CSC可能來(lái)源于癌基因的重編程和癌細(xì)胞的動(dòng)態(tài)特性，因此推測(cè)CSC相關(guān)基因的鑒定將產(chǎn)生新的癌癥治療靶點(diǎn)。目前，CRISPR技術(shù)在腫瘤干細(xì)胞中的應(yīng)用為臨床腫瘤治療提供了新的方向。

  闡明癌癥的起因與發(fā)展
利用CRISPR/Cas9庫(kù)篩選癌細(xì)胞中的功能基因——癌細(xì)胞基因組攜帶多種遺傳變異，這些變異由先天性和后天突變積累，并由連續(xù)的克隆擴(kuò)展觸發(fā)。識(shí)別驅(qū)動(dòng)腫瘤進(jìn)化的基因可以闡明癌癥的起始和發(fā)展。使用CRISPR進(jìn)行功能基因組篩選可以揭示藥物治療后的表型變化，從而確定癌癥治療的新靶點(diǎn)。

  癌癥建模
CRISPR/Cas9在癌癥建模中的應(yīng)用
——CRISPR/Cas9能夠在體內(nèi)構(gòu)建具有多個(gè)基因突變的腫瘤模型，從而更好地模擬復(fù)雜的人類(lèi)疾病，這種新興的建模方法可以對(duì)體內(nèi)外癌癥基因進(jìn)行更有效的研究。

浙江大學(xué)平淵研究員和華東師范大學(xué)程義云教授開(kāi)發(fā)了一種基于CRISPR-Cas9的基因組編輯納米藥物，并將其用于靶向APC和KRAS突變以治療結(jié)直腸癌。

2021年12月3日，廣西醫(yī)科大學(xué)趙永祥團(tuán)隊(duì)發(fā)表題為“Generation of in situ CRISPR-mediated primary and metastatic cancer from monkey liver”的研究論文，該研究產(chǎn)生了一種原位基因編輯方法，以誘導(dǎo)Pten和 p53基因的有效功能喪失突變，用于在成年食蟹猴中使用CRISPR/Cas9 快速建模原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性肝腫瘤。這有望成為一種強(qiáng)大而可行的工具，用于編輯疾病基因在成人NHP中建立相應(yīng)的人類(lèi)疾病模型，大大加快新藥的發(fā)現(xiàn)并節(jié)省經(jīng)濟(jì)成本。

CRISPR/Cas9基因編輯工具在癌癥診斷和治療中的應(yīng)用

（圖片來(lái)自“Application of the CRISPR/Cas9-based gene editing technique in basic research, diagnosis, and therapy of cancer”.）
 

二、CRISPR/Cas系統(tǒng)在植物技術(shù)研究中的應(yīng)用

通過(guò)基因組工程對(duì)植物的遺傳控制使功能基因組學(xué)的生長(zhǎng)和作物物種的遺傳改良成為可能。目前，該系統(tǒng)已在世界各地的許多實(shí)驗(yàn)室中使用，主要用于簡(jiǎn)單地敲除基因，以產(chǎn)生所需的突變體或具有改良農(nóng)業(yè)性狀的新種質(zhì)材料。它對(duì)植物科學(xué)產(chǎn)生了革命性的影響。與其他育種技術(shù)相結(jié)合，CRISPR/Cas9將有助于培育超級(jí)品種，以滿足未來(lái)幾十年人口增長(zhǎng)的需求。

發(fā)表刊物：《Plant Biotechnology Journal》

標(biāo)題：CRISPR/Cas9-mediated genome editing for wheat grain quality improvement

研究團(tuán)隊(duì)：山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所李根英研究員領(lǐng)銜的小麥分子育種創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)
    研究選取了與小麥加工品質(zhì)密切相關(guān)的四個(gè)基因（籽粒硬度基因pinb、淀粉品質(zhì)基因waxy、面粉色澤基因psy和面團(tuán)褐變基因ppo），利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)其進(jìn)行精準(zhǔn)打靶，經(jīng)過(guò)多代純合和鑒定，獲得不含外源轉(zhuǎn)基因成分的基因編輯新種質(zhì)，為小麥品質(zhì)育種提供了新的基因資源。

糧食作物：水稻

發(fā)表刊物：《Plant Biotechnology Journal》

標(biāo)題：Production of aromatic three-line hybrid rice using novel alleles of BADH2

研究團(tuán)隊(duì)：中國(guó)水稻研究所胡培松院士團(tuán)隊(duì)
    該研究通過(guò)CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)創(chuàng)制新型BADH2等位基因系，對(duì)三系雜交稻的香味改良進(jìn)行了大膽實(shí)踐，為三系雜交稻香味性狀改良提供了新思路。

糧食作物：高粱

發(fā)表刊物：《Plant Biotechnology Journal》

標(biāo)題：CRISPR/Cas9-mediated genome editing for wheat grain quality improvement

研究團(tuán)隊(duì)：來(lái)自加州伯克利大學(xué)的Peggy G. Lemaux教授團(tuán)隊(duì)
    傳統(tǒng)的高粱轉(zhuǎn)化方法在驗(yàn)證高粱功能方面存在基因型依賴和選擇、再生和世代推進(jìn)時(shí)間長(zhǎng)的障礙。本研究通過(guò)改良MAT技術(shù)，使得高粱轉(zhuǎn)化效率更高，轉(zhuǎn)化植株的時(shí)間縮短，為驗(yàn)證高粱中許多未表征的基因功能提供了直接的手段。該研究找到的是一種對(duì)難以進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化作物的有效轉(zhuǎn)化方法，并提高了轉(zhuǎn)化效率縮短了轉(zhuǎn)化時(shí)間，加速了對(duì)廣泛生長(zhǎng)、多用途作物的多種基因型的研究。

三、結(jié) 語(yǔ)
  CRISPR基因編輯技術(shù)自問(wèn)世以來(lái)，就以無(wú)可比擬的優(yōu)勢(shì)，深刻改變了基因編輯領(lǐng)域乃至整個(gè)生命科學(xué)的研究模式。如今，CRISPR技術(shù)已被應(yīng)用于精確基因組編輯和轉(zhuǎn)錄調(diào)控等一系列科學(xué)研究，這使得科學(xué)家能夠“隨意”操縱基因序列。
  不僅如此，基于CRISPR技術(shù)的基因療法已經(jīng)開(kāi)始應(yīng)用于臨床治療，特別是一些由基因突變引起的疾病，例如遺傳病和癌癥。
  然而，一些研究卻表明，CRISPR技術(shù)存在重大的潛在風(fēng)險(xiǎn)，包括脫靶效應(yīng)、染色體改變和潛在免疫原性等。脫靶效應(yīng)是CRISPR/Cas9基因治療的明顯缺陷，無(wú)關(guān)的細(xì)胞吸收了CRISPR/Cas9有“大 | 麻煩”，如果將通過(guò)CRISPR/Cas9基因編輯的細(xì)胞用于治療，將會(huì)有潛在致癌性風(fēng)險(xiǎn)，要想解決潛在致癌性這個(gè)問(wèn)題，或許要先解決基因編輯技術(shù)面臨的核心難題—脫靶效應(yīng)。使用CRISPR-Cas9時(shí)，要重點(diǎn)監(jiān)測(cè)癌癥相關(guān)基因突變，特別是p53基因和KRAS基因。
  機(jī)遇與挑戰(zhàn)向來(lái)是共存的，雖然有潛在風(fēng)險(xiǎn)，但CRISPR基因編輯仍是一項(xiàng)蓬勃發(fā)展的革命性技術(shù)。
 

參考文獻(xiàn)

1. Huimin Zhang,,et al(2021). Application of the CRISPR/Cas9-based gene editing technique in basic research, diagnosis, and therapy of cancer. Mol Cancer (2021) 20:126. https://doi.org/10.1186/s12943-021-01431-6

2. Li, Y., Li, W., & Li, J. (2021). The CRISPR/Cas9 Revolution continues: From base editing to prime editing in plant science. Journal of Genetics and Genomics, 48(8), 661–670. https://doi.org/10.1016/j.jgg.2021.05.001