基因組編輯（Genome Editing）又稱基因編輯，是基因工程的一種，指在活體基因組中進(jìn)行DNA插入、刪除、修改或替換的一項技術(shù)。其中，CRISPR/Cas9技術(shù)是目前基因編輯領(lǐng)域內(nèi)應(yīng)用最廣的技術(shù)，該項技術(shù)一經(jīng)誕生就被人們視為21世紀(jì)最為重要的生物發(fā)現(xiàn)之一。它穩(wěn)定高效，已經(jīng)被全球各地的研究人員應(yīng)用在各種生物的基因修復(fù)、基因改造等技術(shù)中。

    然而，這一技術(shù)從被發(fā)現(xiàn)到被廣泛應(yīng)用還不到10年時間。

什么是CRISPR/Cas？

CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats, 規(guī)律間隔成簇短回文重復(fù)序列)，是存在于細(xì)菌和古菌基因組內(nèi)的⼀段重復(fù)序列。

Cas (CRISPR-associated, CRISPR關(guān)聯(lián)）蛋⽩，由總是出現(xiàn)在CRISPR區(qū)域附近的CRISPR關(guān)聯(lián)基因編碼的蛋白。Cas9是其中一種核酸內(nèi)切酶，即能從核酸的內(nèi)部切開雙鏈的酶。

    在自然界中，CRISPR/Cas系統(tǒng)能為細(xì)菌和古⽣菌提供對病毒和質(zhì)粒的適應(yīng)性免疫�，F(xiàn)在，科學(xué)家通過對這個系統(tǒng)的重新設(shè)計和編程，可以精確識別并切斷目標(biāo)DNA，并誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)行DNA修復(fù)，最終實現(xiàn)基因敲除和基因修改。

細(xì)菌的CRISPR。鉆石是“重復(fù)序列”，正方形是重復(fù)序列之間的“間隔成簇”，鉆石與正方形有“規(guī)律”地在染色體內(nèi)密集出現(xiàn)，而不是隨機(jī)分布。
（圖片來自《破天機(jī)——基因編輯及其控制演化的驚人力量》）

“發(fā)現(xiàn)”的歷程

——  1993，西班牙科學(xué)家Francisco Mojica在其他細(xì)菌和古菌中發(fā)現(xiàn)相似的重復(fù)序列，并將其命名為SRSR (Short Regularly Spaced Repeats, 短間隔重復(fù)序列)。
——  2002年，Ruud Jansen及他的同事首次在印刷品中使用CRISPR一詞。他們還發(fā)現(xiàn)這些序列一般可以在CRISPR相關(guān)基因，即Cas基因旁邊找到，而Cas基因所編碼的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與那些能與DNA發(fā)生相互作用的酶的結(jié)構(gòu)很相似。因此，他們推測Cas基因與CRISPR序列存在“功能上的關(guān)系”，但這種關(guān)系的作用還不清楚。

• 病毒DNA⽚段夾在細(xì)菌的重復(fù)結(jié)構(gòu)中，就像是細(xì)菌在基因組⾥收藏了病毒不同⾓度的快照。憑什么僅靠記錄⼀張病毒的快照，細(xì)菌就能夠防御未來的病毒入侵呢？
• 現(xiàn)在我們知道，細(xì)菌在遭到病毒⼊侵后，能夠把病毒基因的⼀⼩段存儲到⾃⾝DNA中的CRISPR序列。當(dāng)再次遇到病毒⼊侵時，細(xì)菌能夠根據(jù)存寫的⽚段識別病毒，將病毒的DNA切斷⽽使之失效。

——  從1993年到2005年間，Mojica發(fā)現(xiàn)，夾在重復(fù)序列之間的間隔序列與許多噬菌體（專門⼊侵細(xì)菌的病毒）的基因組序列信息⾼度⼀致，提出了CRISPR是細(xì)菌的⼀種適應(yīng)性免疫機(jī)制的假設(shè)。
——  2007年，在丹麥丹尼斯克公司（Danisco，世界知名的食品添加劑生產(chǎn)商）⼯作的科學(xué)家Rodolphe Barrangou及其團(tuán)隊證明，在嗜熱鏈球菌（⽣產(chǎn)酸奶必須的⼀種益生菌）中⼈⼯添加⼀段CRISPR序列，可以幫助細(xì)菌抵擋某種對應(yīng)病毒的⼊侵。這是首次通過實驗證明CRISPR的功能與抵抗噬菌體感染有關(guān)。他們還發(fā)現(xiàn)，對于嗜熱鏈球菌而言，Cas基因控制了間隔序列的獲取與整合，而間隔序列可以特異性地靶向識別再次侵染的噬菌體基因組，因此，他們猜想Cas基因在CRISPR實現(xiàn)的免疫過程中起著重要作用，但其中細(xì)節(jié)尚不清楚。2008年，荷蘭科學(xué)家John van der Oost的團(tuán)隊通過在大腸桿菌中的實驗證實，小RNA分子協(xié)助了細(xì)菌抗病毒反應(yīng)中的識別和摧毀過程，他們稱之為CRISPR RNA (crRNA)。同時，他們還通過人為設(shè)計相應(yīng)的crRNA序列使細(xì)菌獲得了抵抗噬菌體的特性，這是人類首次編輯CRISPR系統(tǒng)。

• CRISPR的RNA分子如何在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生，并從長鏈RNA轉(zhuǎn)化成更短的、只包含單一病毒配對RNA的片段？
• 細(xì)菌細(xì)胞把整個CRISPR序列翻譯成一條長RNA鏈，一種酶把它切成更短的RNA鏈，它們長度一致，但間隔序列不同。這個過程把DNA中較長的重復(fù)序列變成了更短的RNA分子文庫，每一個RNA分子都包含一段特定的噬菌體序列。

• 什么是PAM，PAM在CRISPR/Cas系統(tǒng)中起到什么作用？
• PAM（Protospacer Adjacent Motif）是入侵病毒的一部分，但不在細(xì)菌CRISPR中出現(xiàn)。如果目標(biāo)DNA序列后面沒有PAM序列，Cas9將不能對目標(biāo)DNA進(jìn)行干擾。PAM對靶向識別起著重要作用，它能幫助區(qū)分細(xì)菌自身和非自身DNA，從而防止細(xì)菌本身被CRISPR相關(guān)核酸酶鎖定和破壞。

——  2011年3月，瑞典于默奧⼤學(xué)的法國科學(xué)家Emmanuelle Charpentier領(lǐng)導(dǎo)的實驗室在發(fā)現(xiàn)，除了crRNA外，還存在第⼆個RNA分子，他們稱之為trans-activating crRNA (tracrRNA)。在化膿鏈球菌中，tracrRNA對于病毒的失活是必需的。tracrRNA與crRNA形成雙鏈體，將Cas9蛋白（當(dāng)時被稱為Csn1蛋白）引導(dǎo)⾄其靶標(biāo)。
——  2011年8月，立陶宛維爾紐斯大學(xué)的科學(xué)家Virginijus Siksnys和丹麥丹尼斯克公司的科學(xué)家，在大腸桿菌中重組了嗜熱鏈球菌的CRISPR系統(tǒng)，這種重建的CRISPR系統(tǒng)仍然可以實現(xiàn)對噬菌體DNA的靶向干擾。此外，他們還證明了，對于嗜熱鏈球菌對應(yīng)的CRISPR/Cas系統(tǒng)而言，Cas9核酸酶是是實現(xiàn)干擾所需要的唯/一蛋白質(zhì)，這是II類CRISPR系統(tǒng)的顯著特征（I類CRISPR/Cas系統(tǒng)中，RNA與多個Cas蛋白結(jié)合，形成識別和切割DNA的分子復(fù)合體；II類CRISPR/Cas系統(tǒng)則是由單個效應(yīng)Cas蛋白來發(fā)揮功能）。

至此，細(xì)菌CRISPR/Cas9系統(tǒng)切割噬菌體DNA的三個核心要件：Cas9、crRNA和tracrRNA皆被發(fā)現(xiàn)。

（圖片來自《破天機(jī)——基因編輯及其控制演化的驚人力量》）

——  2012年6⽉28日，美國加州⼤學(xué)伯克利分校的科學(xué)家Jennifer Doudna和瑞典于默奧⼤學(xué)的科學(xué)家Emmanuelle Charpentier領(lǐng)銜的研究團(tuán)隊合作在Science雜志發(fā)表論⽂（2012年6月8日投稿），他們通過體外試驗證明，crRNA通過堿基互補(bǔ)配對與tracrRNA形成特殊的雙鏈RNA結(jié)構(gòu)，指導(dǎo)Cas9在靶標(biāo)DNA上引起雙鏈斷裂。團(tuán)隊還將系統(tǒng)所需的兩條RNA融合改造成⼀條更加易⽤的單鏈向?qū)�RNA (single-guide RNA, sgRNA)，并證明了⼈⼯設(shè)計的向?qū)�RNA同樣可以指導(dǎo)Cas9蛋⽩切割任意指定的⼀段DNA序列。

2020年10月，這兩位科學(xué)家被授予2020年諾貝爾化學(xué)獎，以表彰她們對“基因剪刀”CRISPR/Cas9的貢獻(xiàn)。
（圖片來自 nobelprize.org）

 

參考文獻(xiàn)

1.王立銘. 上帝的手術(shù)刀——基因編輯簡史[M]. 浙江: 浙江人民出版社, 2017.

2.[美] 詹尼佛·A.杜德娜、[美]塞繆爾·H·斯坦伯格. 破天機(jī)——基因編輯及其控制演化的驚人力量[M]. 湖南: 湖南科學(xué)技術(shù)出版社, 2020.