DAP-seq助力揭示GhSBI1調(diào)控棉花果枝節(jié)間伸長(zhǎng)的分子機(jī)制
2024年7月26日，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所張永山研究員團(tuán)隊(duì)在Plant Biotechnology Journal（影響因子10.1）雜志上發(fā)表了題為“GhSBI1, a CUP-SHAPED COTYLEDON 2 homologue, modulates branch internode elongation in cotton”的文章，該研究借助DAP-seq和轉(zhuǎn)錄組等技術(shù)，鑒定了GhSBI1下游靶標(biāo)基因，揭示了其對(duì)棉花果枝節(jié)間伸長(zhǎng)的抑制作用機(jī)制。
研究背景：
棉花（Gossypium）是世界上主要的天然纖維來(lái)源，也是重要的油料和蛋白作物。理想的株型結(jié)構(gòu)可提高棉花單位面積產(chǎn)量和機(jī)械化采收的效率。果枝長(zhǎng)度是棉花株型重要的影響因子，適合高密度種植的緊湊株型結(jié)構(gòu)是棉花重要的育種目標(biāo)。鑒定調(diào)控棉花果枝長(zhǎng)度的基因，并揭示其調(diào)控株型等農(nóng)藝性狀的分子機(jī)制具有重要理論價(jià)值和應(yīng)用前景。
實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：
轉(zhuǎn)錄組研究：對(duì)照組YZ-1，GhSBI1過(guò)表達(dá)處理組OE1和OE2，所有樣本均采集三個(gè)生物學(xué)重復(fù)，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。
DAP-seq研究：轉(zhuǎn)錄因子GhSBI1，從標(biāo)準(zhǔn)遺傳株系陸地棉莖尖提取基因組DNA。
主要研究結(jié)果：
棉花（Gossypium）是世界上主要的天然纖維來(lái)源，也是重要的油料和蛋白作物。理想的株型結(jié)構(gòu)可提高棉花單位面積產(chǎn)量和機(jī)械化采收的效率。果枝長(zhǎng)度是棉花株型重要的影響因子，適合高密度種植的緊湊株型結(jié)構(gòu)是棉花重要的育種目標(biāo)。鑒定調(diào)控棉花果枝長(zhǎng)度的基因，并揭示其調(diào)控株型等農(nóng)藝性狀的分子機(jī)制具有重要理論價(jià)值和應(yīng)用前景。
實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：
轉(zhuǎn)錄組研究：對(duì)照組YZ-1，GhSBI1過(guò)表達(dá)處理組OE1和OE2，所有樣本均采集三個(gè)生物學(xué)重復(fù)，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。
DAP-seq研究：轉(zhuǎn)錄因子GhSBI1，從標(biāo)準(zhǔn)遺傳株系陸地棉莖尖提取基因組DNA。
主要研究結(jié)果：
1. 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序
利用轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果獲得組間差異基因的表達(dá)情況。通過(guò)對(duì)兩個(gè)GhSBI1過(guò)表達(dá)處理組（OE1和OE2）進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序來(lái)識(shí)別GhSBI1影響的基因。轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果顯示，差異基因顯著富集在植物激素信號(hào)通路。
圖1 GhSBI1調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果
2. DAP-seq分析
DAP-seq分析結(jié)果共鑒定出19,555個(gè)peak（富集區(qū)域），其中3,532個(gè)（18%）結(jié)合位點(diǎn)位于啟動(dòng)子（ATG上游≤3 kb）區(qū)域。對(duì)注釋到啟動(dòng)子的peak相關(guān)基因（3,466個(gè)）進(jìn)行GO富集，分析結(jié)果顯示，這些基因在細(xì)胞分裂或細(xì)胞壁組織相關(guān)的生物過(guò)程中顯著富集。同時(shí)還檢測(cè)到轉(zhuǎn)錄因子GhSBI1可靠的結(jié)合motif：5’-GDTTRCTTGTNNNACAAGYAAHC-3’。
圖2 通過(guò)DAP-seq 在全基因組范圍內(nèi)鑒定GhSBI1結(jié)合位點(diǎn)。
3. DAP-seq與轉(zhuǎn)錄組聯(lián)合分析
作者將DAP-seq數(shù)據(jù)與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)聯(lián)合分析來(lái)進(jìn)一步確定GhSBI1直接調(diào)控參與棉花節(jié)間伸長(zhǎng)的核心基因。聯(lián)合分析發(fā)現(xiàn)464個(gè)重疊基因，其中172個(gè)基因（37個(gè)上調(diào)和135個(gè)下調(diào)）在GhSBI1過(guò)表達(dá)處理組OE1和OE2之間是共同存在的。作者選擇其中與激素生物合成/信號(hào)傳導(dǎo)或細(xì)胞擴(kuò)張相關(guān)的基因進(jìn)一步分析，候選基因是GID1B，JAZ8，GA3OX1，EXPANSIN 11。隨后利用電泳遷移率實(shí)驗(yàn)EMSA驗(yàn)證了GhSBI1在體外與目標(biāo)基因的核心motif的結(jié)合。通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)（Dual-LUC）發(fā)現(xiàn)，在GhGAI3的幫助下，GhSBI1可以抑制靶基因的表達(dá)（GhJAZ8-1_Dt除外）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明GhSBI1通過(guò)直接與赤霉素生物合成/信號(hào)傳導(dǎo)或細(xì)胞擴(kuò)張基因的啟動(dòng)子結(jié)合，抑制靶基因的表達(dá)，導(dǎo)致棉花枝節(jié)間伸長(zhǎng)的減少。
作者將DAP-seq數(shù)據(jù)與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)聯(lián)合分析來(lái)進(jìn)一步確定GhSBI1直接調(diào)控參與棉花節(jié)間伸長(zhǎng)的核心基因。聯(lián)合分析發(fā)現(xiàn)464個(gè)重疊基因，其中172個(gè)基因（37個(gè)上調(diào)和135個(gè)下調(diào)）在GhSBI1過(guò)表達(dá)處理組OE1和OE2之間是共同存在的。作者選擇其中與激素生物合成/信號(hào)傳導(dǎo)或細(xì)胞擴(kuò)張相關(guān)的基因進(jìn)一步分析，候選基因是GID1B，JAZ8，GA3OX1，EXPANSIN 11。隨后利用電泳遷移率實(shí)驗(yàn)EMSA驗(yàn)證了GhSBI1在體外與目標(biāo)基因的核心motif的結(jié)合。通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)（Dual-LUC）發(fā)現(xiàn)，在GhGAI3的幫助下，GhSBI1可以抑制靶基因的表達(dá)（GhJAZ8-1_Dt除外）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明GhSBI1通過(guò)直接與赤霉素生物合成/信號(hào)傳導(dǎo)或細(xì)胞擴(kuò)張基因的啟動(dòng)子結(jié)合，抑制靶基因的表達(dá)，導(dǎo)致棉花枝節(jié)間伸長(zhǎng)的減少。
圖3 GhSBI1對(duì)棉花節(jié)間伸長(zhǎng)基因的直接調(diào)控
結(jié)果與討論：
GhSBI1是棉花株型的重要調(diào)節(jié)因子，其表達(dá)增加會(huì)使棉花果枝和葉柄節(jié)間縮短，敲除GhSBI1也會(huì)導(dǎo)致節(jié)間長(zhǎng)度減少，因此適當(dāng)?shù)?em>GhSBI1表達(dá)水平對(duì)棉花節(jié)間正常伸長(zhǎng)至關(guān)重要。GhSBI1可與GhGAIs相互作用，通過(guò)影響赤霉素生物合成和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的關(guān)鍵基因來(lái)調(diào)節(jié)果枝節(jié)間伸長(zhǎng)。該研究成果為棉花株型和產(chǎn)量的分子改良提供了基因儲(chǔ)備和材料基礎(chǔ)，為棉花株型調(diào)控分子機(jī)制解析提供了新思路。
圖4 GhSBI1影響棉花節(jié)間長(zhǎng)度的調(diào)控機(jī)制模型
藍(lán)景科信擁有100+物種，2000+轉(zhuǎn)錄因子的實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)，已助力客戶在許多期刊發(fā)表文章，包括Cell，Molecular Plant，The Plant Cell，Plant Physiology，Plant Biotechnology Journal，New Phytologist等。
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