RRBS揭示MOF對UHRF1乙�；揎検荄NA甲基化維持的關(guān)鍵調(diào)控機制
DNA甲基化是一種重要的表觀遺傳修飾，其在基因表達調(diào)控、基因組穩(wěn)定性和細胞分化中起著關(guān)鍵作用。UHRF1（ubiquitin-like, containing PHD and RING finger domains, 1）是一種多結(jié)構(gòu)域蛋白，可作為表觀遺傳修飾因子發(fā)揮作用，能夠招募DNMT1以維持DNA甲基化。在DNA復制過程中，UHRF1通過識別半甲基化的DNA和結(jié)合組蛋白H3來定位到新合成的DNA上，并通過其E3泛素連接酶活性泛素化組蛋白H3，從而促進DNMT1的招募和DNA甲基化的維持。然而，UHRF1乙�；揎椉捌鋵NA甲基化維持的具體作用機制尚不清楚。
近日，廣東省人民醫(yī)院心血管研究所/廣東省人民醫(yī)院醫(yī)學研究所/香港大學生物醫(yī)學院王霖晟博士等為第一作者，廣東省人民醫(yī)院醫(yī)學研究所/香港大學生物醫(yī)學院/香港大學深圳醫(yī)院骨科中心周中軍教授、廣東省人民醫(yī)院醫(yī)學研究所金國祥研究員為共同通訊作者，在《Cell Reports》期刊發(fā)表題為《MOF-mediated acetylation of UHRF1 enhances UHRF1 E3 ligase activity to facilitate DNA methylation maintenance》的研究論文。研究揭示了MOF（males absent on the first）對UHRF1蛋白的乙酰化修飾如何調(diào)節(jié)DNA甲基化維持過程。研究發(fā)現(xiàn)，MOF能夠乙�；疷HRF1的K670位點，而HDAC1（histone deacetylase 1）則能夠去乙�；撐稽c。這種乙�；揎椩鰪娏薝HRF1的E3泛素連接酶活性，進而促進了組蛋白H3泛素化，這對于DNMT1（DNA methyltransferase 1）的招募和DNA甲基化維持至關(guān)重要。
標題：MOF-mediated acetylation of UHRF1 enhances UHRF1 E3 ligase activity to facilitate DNA methylation maintenance（MOF介導的UHRF1乙�；鰪娏薝HRF1 E3連接酶活性以促進DNA甲基化維持）
期刊：Cell Reports
影響因子：IF 7.5/Q1
技術(shù)平臺：RRBS等（易基因金牌技術(shù)）
本研究結(jié)果表明，MOF能夠乙酰化UHRF1的K670位點，該位點位于pre-RING連接區(qū)，而HDAC1則能夠去乙�；疷HRF1的同一位點。此外，當K670發(fā)生突變時，MOF還可以乙�；疜667和K668位點。MOF/HDAC1介導的UHRF1乙�；芗毎芷谡{(diào)控，并在G1/S期達到峰值，這與UHRF1招募DNMT1以維持DNA甲基化的功能相一致。此外，UHRF1乙�；@著增強了其E3泛素連接酶活性。在這些位點上消除UHRF1乙�；瘯䴗p弱UHRF1介導的H3泛素化，進而影響DNMT1的招募和DNA甲基化。綜合來看，這些發(fā)現(xiàn)確定了MOF是UHRF1的乙酰轉(zhuǎn)移酶，并明確了通過MOF介導的UHRF1乙�；{(diào)節(jié)DNA甲基化維持的機制。
研究亮點
研究摘要
研究方法
細胞實驗：在HEK293T細胞中進行了一系列細胞實驗，包括共轉(zhuǎn)染不同組的質(zhì)粒、免疫共沉淀、免疫熒光染色等，以研究UHRF1乙酰化修飾及其對DNA甲基化的影響。
體外實驗：通過體外乙酰化實驗，使用純化的GST-UHRF1和GST-MOF蛋白，驗證了MOF對UHRF1的直接乙�；饔�。
質(zhì)譜分析：利用質(zhì)譜技術(shù)分析了MOF介導的UHRF1乙�；稽c，確定K670為主要乙�；稽c，同時K667和K668也可以被乙�；�。
基因敲除和敲低實驗：通過siRNA敲低MOF或在小鼠胚胎干細胞（ESCs）中敲除UHRF1，研究其對DNA甲基化的影響。
DNA甲基化分析：采用免疫熒光染色、簡化基因組亞硫酸鹽測序（RRBS）等方法，分析DNA甲基化水平和模式的變化。
結(jié)果圖形
（1）MOF和HDAC1分別是UHRF1的乙酰轉(zhuǎn)移酶和去乙�；�
（B）將空載體或Myc-MOF質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到HEK293T細胞中。轉(zhuǎn)染48小時后，對內(nèi)源性UHRF1進行免疫沉淀，并使用UHRF1和泛乙酰化賴氨酸抗體進行Western Blot分析。在免疫沉淀（IP）中使用免疫球蛋白G（IgG）作為UHRF1抗體的對照。
（C）通過將純化的GST-UHRF1和GST-MOF與乙酰輔酶A（acetyl-CoA）共同孵育進行體外乙�；瘜嶒�。對照實驗在沒有乙酰輔酶A的情況下進行。使用乙�；嚢彼峥贵w檢測UHRF1的乙�；闆r，并通過GST抗體檢測UHRF1和MOF蛋白。
（D）將對照組和MOF小分子干擾RNA（siRNA）轉(zhuǎn)染到表達外源FLAG-Myc-UHRF1的HEK293T細胞中。使用FLAG抗體對細胞裂解物進行免疫沉淀，并使用針對FLAG和乙酰化賴氨酸的抗體進行Western Blot分析。
（E）在共轉(zhuǎn)染FLAG-Myc-UHRF1和空載體或Myc-HDAC1的HEK293T細胞中，使用FLAG抗體進行免疫沉淀，隨后使用針對泛乙�；嚢彼�、UHRF1和HDAC1的抗體進行Western Blot分析。
（2）MOF在pre-RING連接區(qū)的K670位點周圍乙酰化UHRF1。
通過質(zhì)譜分析和突變實驗，確定了MOF主要乙�；疷HRF1的K670位點，而K667和K668在K670突變時也可以被乙�；�。
（B）上圖展示了用于乙�；治龅腢HRF1和缺失連接區(qū)的構(gòu)建體示意圖。通過定點突變技術(shù)生成缺失連接區(qū)的UHRF1突變體構(gòu)建體。將UHRF1構(gòu)建體單獨或與Myc-MOF共轉(zhuǎn)染到HEK293T細胞中。使用FLAG抗體進行免疫沉淀后，通過Western Blot分析檢測input樣本和沉淀樣本中的Myc和泛乙酰化賴氨酸。
（B）在有無MOF存在的情況下，野生型UHRF1片段（601-793氨基酸）及各種突變型UHRF1片段（601-793氨基酸）的乙�；闆r。外源性野生型UHRF1片段和不同突變型UHRF1片段經(jīng)FLAG抗體免疫沉淀后，使用泛乙�；嚢彼峥贵w進行Western Blot分析。input樣本用Myc抗體分析外源性UHRF1片段和MOF的表達情況。
（C）在FLAG-Myc-UHRF1質(zhì)粒中，靶向K667/K668/K670賴氨酸簇進行了賴氨酸到精氨酸的突變。將野生型或UHRF1點突變構(gòu)建體（均帶有FLAG-Myc標簽）單獨或與Myc-MOF共轉(zhuǎn)染到HEK293T細胞中。使用FLAG抗體進行免疫沉淀后，通過Western Blot分析檢測Myc和乙�；嚢彼帷�
（D）通過將純化的GST-UHRF1或突變型K667R/K668R/K670R（3KR）-UHRF1和GST-MOF與乙酰輔酶A（acetyl-CoA）共同孵育進行體外乙�；瘜嶒�。對照實驗在沒有乙酰輔酶A的情況下進行。使用乙酰化賴氨酸抗體檢測UHRF1的乙�；闆r，并通過GST抗體檢測UHRF1和MOF蛋白。
（3）MOF在G1期和S期乙�；疷HRF1，并促進DNA甲基化。
UHRF1乙�；皆诩毎芷诘腉1/S期達到峰值，與UHRF1招募DNMT1的功能相一致。在UHRF1的K670、K667和K668位點突變的細胞中，DNA甲基化水平顯著降低，表明這些位點的乙�；瘜NA甲基化維持至關(guān)重要。
（B）穩(wěn)定轉(zhuǎn)染野生型FLAG-Myc-UHRF1并瞬時轉(zhuǎn)染MOF siRNA的HEK293T細胞通過雙重胸苷阻斷同步化，隨后進行細胞周期釋放，并進行與（A）相同的分析。
（C）在野生型和Uhrf1-/-小鼠胚胎干細胞（ESCs）中，以及通過FLAG-Myc標記的野生型UHRF1（FL）或3KR或ΔRING突變體UHRF1構(gòu)建體遺傳互補的Uhrf1 Uhrf1-/-小鼠胚胎干細胞（ESCs）中，使用特異性5mC抗體進行代表性免疫熒光分析。
（D）在Uhrf1 Uhrf1-/-小鼠胚胎干細胞（ESCs）中穩(wěn)定表達的FLAG-Myc標記的人類野生型UHRF1和3KR突變體UHRF1通過西方印跡分析，使用UHRF1抗體進行分析。β-肌動蛋白用作加載對照。選擇兩個突變克隆和一個野生型克隆，其UHRF1表達水平與野生型ESCs中內(nèi)源性UHRF1水平相似，用于后續(xù)研究。
（E）通過RRBS測序檢測的野生型和Uhrf1 Uhrf1-/-小鼠胚胎干細胞（ESCs）以及通過FLAG-Myc標記的野生型UHRF1（hUHRF1）或3KR（克隆#2）UHRF1構(gòu)建體遺傳互補的Uhrf1-/-小鼠胚胎干細胞（ESCs）中，基因區(qū)域各個部分的全局CG甲基化水平。
（F）在對照ESCs、Uhrf1 Uhrf1-/-ESCs以及穩(wěn)定表達人類野生型或3KR突變體UHRF1的Uhrf1 Uhrf1-/-ESCs中，通過亞硫酸鹽測序分析IAP和LINE1位點的DNA甲基化狀態(tài)。
（4）MOF/HDAC1介導的UHRF1乙�；瘜τ谕ㄟ^H3泛素化在DNA甲基化維持過程中高效招募DNMT1至關(guān)重要
乙酰化突變的UHRF1不能有效地招募DNMT1到異染色質(zhì)區(qū)域，導致DNA甲基化缺陷。且乙酰化突變的UHRF1顯著降低了其對組蛋白H3的E3泛素連接酶活性，進而影響DNMT1招募。
（B）來自至少三次重復實驗的代表性Western Blot分析，用于檢測野生型小鼠胚胎干細胞（ESCs）、Uhrf1-/-小鼠胚胎干細胞（ESCs）以及表達外源性人類FLAG-Myc標記的野生型UHRF1或3KR（兩個克�。┩蛔凅wUHRF1的Uhrf1-/-小鼠胚胎干細胞（ESCs）中的泛素化組蛋白H3。
（C）在HEK293T細胞中組蛋白H3.1泛素化。在存在MOF、HDAC1、MOF siRNA或HDAC1 siRNA的情況下，從HEK293T細胞中免疫沉淀的外源性FLAG-H3.1的泛素化通過Western Blot進行檢測。將裂解液進行FLAG抗體的免疫沉淀（IP），以沉淀外源性組蛋白H3.1，隨后使用FLAG和血凝素（HA）抗體進行免疫印跡分析，以檢測H3.1和HA標記的泛素。在FLAG IP樣本中顯示的HA標記的泛素反映了FLAG-H3.1的泛素化水平。
（D）在HEK293T細胞中PML4的泛素化。將HA-PML4、Myc-UHRF1和FLAG-泛素構(gòu)建體轉(zhuǎn)染到HEK293T細胞中，在有無MOF或HDAC1存在的情況下進行實驗。在收獲前6小時用5μM MG132處理細胞。將細胞裂解液進行HA抗體的免疫沉淀，以沉淀外源性表達的野生型HA-PML4，隨后使用HA、FLAG抗體進行免疫印跡分析，以檢測PML4和FLAG標記的泛素。
（5）在小鼠胚胎干細胞（ESCs）中敲低Mof會降低DNA甲基化水平。
（B）對野生型、Uhrf1-/-和Mof敲低小鼠胚胎干細胞（ESCs）中的5mC水平進行免疫熒光染色。對內(nèi)源性H4K16ac進行染色以反映Mof乙酰轉(zhuǎn)移酶活性。
（C）通過RRBS測序檢測的野生型和Mof敲低（clone 1）小鼠胚胎干細胞（ESCs）基因組DNA在不同基因組區(qū)域的整體CpG DNA甲基化譜。
（D）在野生型、Uhrf1-/-和穩(wěn)定敲低Mof的野生型小鼠胚胎干細胞（ESCs）中，通過亞硫酸鹽測序分析IAP和LINE1位點的DNA甲基化情況。
易小結(jié)
本研究揭示了MOF對UHRF1的乙�；揎検荄NA甲基化維持的關(guān)鍵調(diào)控機制。UHRF1的K670、K667和K668位點的乙酰化增強了其E3泛素連接酶活性，促進了組蛋白H3泛素化，從而有助于DNMT1招募和DNA甲基化維持。這一發(fā)現(xiàn)不僅為理解DNA甲基化維持的分子機制提供了新視角，還可能為相關(guān)疾病的治療提供潛在靶點。
RRBS在本研究中的作用
RRBS（Reduced Representation Bisulfite Sequencing）是一種用于分析基因組中DNA甲基化模式的技術(shù)。在本研究中，RRBS被用于分析不同基因型小鼠胚胎干細胞（包括野生型、UHRF1敲除型和表達突變UHRF1的細胞）的全基因組DNA甲基化水平。
Xu X, Wang H, Han H, Yao Y, Li X, Qi J, Cai C, Zhou M, Tang Y, Pan T, Zhang Z, Yang J, Wu D, Han Y. Clinical characteristics and prognostic significance of DNA methylation regulatory gene mutations in acute myeloid leukemia. Clin Epigenetics. 2023 Mar 29;15(1):54. pii: 10.1186/s13148-023-01474-0. doi: 10.1186/s13148-023-01474-0.
近日，廣東省人民醫(yī)院心血管研究所/廣東省人民醫(yī)院醫(yī)學研究所/香港大學生物醫(yī)學院王霖晟博士等為第一作者，廣東省人民醫(yī)院醫(yī)學研究所/香港大學生物醫(yī)學院/香港大學深圳醫(yī)院骨科中心周中軍教授、廣東省人民醫(yī)院醫(yī)學研究所金國祥研究員為共同通訊作者，在《Cell Reports》期刊發(fā)表題為《MOF-mediated acetylation of UHRF1 enhances UHRF1 E3 ligase activity to facilitate DNA methylation maintenance》的研究論文。研究揭示了MOF（males absent on the first）對UHRF1蛋白的乙酰化修飾如何調(diào)節(jié)DNA甲基化維持過程。研究發(fā)現(xiàn)，MOF能夠乙�；疷HRF1的K670位點，而HDAC1（histone deacetylase 1）則能夠去乙�；撐稽c。這種乙�；揎椩鰪娏薝HRF1的E3泛素連接酶活性，進而促進了組蛋白H3泛素化，這對于DNMT1（DNA methyltransferase 1）的招募和DNA甲基化維持至關(guān)重要。
標題：MOF-mediated acetylation of UHRF1 enhances UHRF1 E3 ligase activity to facilitate DNA methylation maintenance（MOF介導的UHRF1乙�；鰪娏薝HRF1 E3連接酶活性以促進DNA甲基化維持）
期刊：Cell Reports
影響因子：IF 7.5/Q1
技術(shù)平臺：RRBS等（易基因金牌技術(shù)）
本研究結(jié)果表明，MOF能夠乙酰化UHRF1的K670位點，該位點位于pre-RING連接區(qū)，而HDAC1則能夠去乙�；疷HRF1的同一位點。此外，當K670發(fā)生突變時，MOF還可以乙�；疜667和K668位點。MOF/HDAC1介導的UHRF1乙�；芗毎芷谡{(diào)控，并在G1/S期達到峰值，這與UHRF1招募DNMT1以維持DNA甲基化的功能相一致。此外，UHRF1乙�；@著增強了其E3泛素連接酶活性。在這些位點上消除UHRF1乙�；瘯䴗p弱UHRF1介導的H3泛素化，進而影響DNMT1的招募和DNA甲基化。綜合來看，這些發(fā)現(xiàn)確定了MOF是UHRF1的乙酰轉(zhuǎn)移酶，并明確了通過MOF介導的UHRF1乙�；{(diào)節(jié)DNA甲基化維持的機制。
研究亮點
- MOF在K670位點乙�；疷HRF1，這一過程可被HDAC1消除。
- MOF介導的乙�；鰪娏薝HRF1的E3泛素連接酶活性。
- 消除UHRF1乙�；瘯种平M蛋白H3泛素化及DNMT1招募。
- UHRF1的K670位點乙�；癁镈NA甲基化維持的正常功能所必需。
研究摘要
研究方法
細胞實驗：在HEK293T細胞中進行了一系列細胞實驗，包括共轉(zhuǎn)染不同組的質(zhì)粒、免疫共沉淀、免疫熒光染色等，以研究UHRF1乙酰化修飾及其對DNA甲基化的影響。
體外實驗：通過體外乙酰化實驗，使用純化的GST-UHRF1和GST-MOF蛋白，驗證了MOF對UHRF1的直接乙�；饔�。
質(zhì)譜分析：利用質(zhì)譜技術(shù)分析了MOF介導的UHRF1乙�；稽c，確定K670為主要乙�；稽c，同時K667和K668也可以被乙�；�。
基因敲除和敲低實驗：通過siRNA敲低MOF或在小鼠胚胎干細胞（ESCs）中敲除UHRF1，研究其對DNA甲基化的影響。
DNA甲基化分析：采用免疫熒光染色、簡化基因組亞硫酸鹽測序（RRBS）等方法，分析DNA甲基化水平和模式的變化。
結(jié)果圖形
（1）MOF和HDAC1分別是UHRF1的乙酰轉(zhuǎn)移酶和去乙�；�
圖1：UHRF1特異性地被MOF乙酰化，并被HDAC1去乙�；�
（A）在HEK293T細胞中共表達FLAG-Myc-UHRF1和不同的組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶（HATs）。使用FLAG抗體對細胞裂解物進行免疫沉淀，并通過乙酰化賴氨酸抗體進行免疫印跡分析以檢測乙�；腢HRF1。EV代表對照組。（B）將空載體或Myc-MOF質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到HEK293T細胞中。轉(zhuǎn)染48小時后，對內(nèi)源性UHRF1進行免疫沉淀，并使用UHRF1和泛乙酰化賴氨酸抗體進行Western Blot分析。在免疫沉淀（IP）中使用免疫球蛋白G（IgG）作為UHRF1抗體的對照。
（C）通過將純化的GST-UHRF1和GST-MOF與乙酰輔酶A（acetyl-CoA）共同孵育進行體外乙�；瘜嶒�。對照實驗在沒有乙酰輔酶A的情況下進行。使用乙�；嚢彼峥贵w檢測UHRF1的乙�；闆r，并通過GST抗體檢測UHRF1和MOF蛋白。
（D）將對照組和MOF小分子干擾RNA（siRNA）轉(zhuǎn)染到表達外源FLAG-Myc-UHRF1的HEK293T細胞中。使用FLAG抗體對細胞裂解物進行免疫沉淀，并使用針對FLAG和乙酰化賴氨酸的抗體進行Western Blot分析。
（E）在共轉(zhuǎn)染FLAG-Myc-UHRF1和空載體或Myc-HDAC1的HEK293T細胞中，使用FLAG抗體進行免疫沉淀，隨后使用針對泛乙�；嚢彼�、UHRF1和HDAC1的抗體進行Western Blot分析。
（2）MOF在pre-RING連接區(qū)的K670位點周圍乙酰化UHRF1。
通過質(zhì)譜分析和突變實驗，確定了MOF主要乙�；疷HRF1的K670位點，而K667和K668在K670突變時也可以被乙�；�。
圖2：MOF在pre-RING連接區(qū)乙�；疷HRF1
（A）上圖展示了用于乙�；治龅囊吧蚒HRF1和缺失不同結(jié)構(gòu)域的UHRF1突變體示意圖。將不同的Myc標記的UHRF1構(gòu)建體單獨或與FLAG-MOF共轉(zhuǎn)染到HEK293T細胞中。使用Myc抗體進行免疫沉淀（IP）后，通過Western Blot分析檢測input樣本和沉淀樣本中的Myc、FLAG或乙�；嚢彼帷�（B）上圖展示了用于乙�；治龅腢HRF1和缺失連接區(qū)的構(gòu)建體示意圖。通過定點突變技術(shù)生成缺失連接區(qū)的UHRF1突變體構(gòu)建體。將UHRF1構(gòu)建體單獨或與Myc-MOF共轉(zhuǎn)染到HEK293T細胞中。使用FLAG抗體進行免疫沉淀后，通過Western Blot分析檢測input樣本和沉淀樣本中的Myc和泛乙酰化賴氨酸。
圖3：通過定點突變鑒定MOF介導的UHRF1乙�；稽c
（A）通過質(zhì)譜分析鑒定出的UHRF1中得分最高的10個乙�；嚢彼嵛稽c示意圖。（B）在有無MOF存在的情況下，野生型UHRF1片段（601-793氨基酸）及各種突變型UHRF1片段（601-793氨基酸）的乙�；闆r。外源性野生型UHRF1片段和不同突變型UHRF1片段經(jīng)FLAG抗體免疫沉淀后，使用泛乙�；嚢彼峥贵w進行Western Blot分析。input樣本用Myc抗體分析外源性UHRF1片段和MOF的表達情況。
（C）在FLAG-Myc-UHRF1質(zhì)粒中，靶向K667/K668/K670賴氨酸簇進行了賴氨酸到精氨酸的突變。將野生型或UHRF1點突變構(gòu)建體（均帶有FLAG-Myc標簽）單獨或與Myc-MOF共轉(zhuǎn)染到HEK293T細胞中。使用FLAG抗體進行免疫沉淀后，通過Western Blot分析檢測Myc和乙�；嚢彼帷�
（D）通過將純化的GST-UHRF1或突變型K667R/K668R/K670R（3KR）-UHRF1和GST-MOF與乙酰輔酶A（acetyl-CoA）共同孵育進行體外乙�；瘜嶒�。對照實驗在沒有乙酰輔酶A的情況下進行。使用乙酰化賴氨酸抗體檢測UHRF1的乙�；闆r，并通過GST抗體檢測UHRF1和MOF蛋白。
（3）MOF在G1期和S期乙�；疷HRF1，并促進DNA甲基化。
UHRF1乙�；皆诩毎芷诘腉1/S期達到峰值，與UHRF1招募DNMT1的功能相一致。在UHRF1的K670、K667和K668位點突變的細胞中，DNA甲基化水平顯著降低，表明這些位點的乙�；瘜NA甲基化維持至關(guān)重要。
圖4：UHRF1的細胞周期依賴性乙�；捌湟阴；蛔凅w對DNA甲基化維持的影響
（A）在穩(wěn)定表達FLAG-Myc-UHRF1的HEK293T細胞中，UHRF1乙�；皆诩毎芷谥械拇硇运�。在細胞周期釋放后的不同時間點收集細胞裂解物，并使用FLAG抗體對FLAG標記的UHRF1進行免疫沉淀。使用乙�；嚢彼岷蚿S652-UHRF1抗體分析免疫沉淀樣本中UHRF1的總乙�；蚿S652磷酸化水平。使用FLAG抗體檢測沉淀物中UHRF1的加載量。pS652-UHRF1水平用作細胞周期標記，因為它在G2/M期達到峰值。（B）穩(wěn)定轉(zhuǎn)染野生型FLAG-Myc-UHRF1并瞬時轉(zhuǎn)染MOF siRNA的HEK293T細胞通過雙重胸苷阻斷同步化，隨后進行細胞周期釋放，并進行與（A）相同的分析。
（C）在野生型和Uhrf1-/-小鼠胚胎干細胞（ESCs）中，以及通過FLAG-Myc標記的野生型UHRF1（FL）或3KR或ΔRING突變體UHRF1構(gòu)建體遺傳互補的Uhrf1 Uhrf1-/-小鼠胚胎干細胞（ESCs）中，使用特異性5mC抗體進行代表性免疫熒光分析。
（D）在Uhrf1 Uhrf1-/-小鼠胚胎干細胞（ESCs）中穩(wěn)定表達的FLAG-Myc標記的人類野生型UHRF1和3KR突變體UHRF1通過西方印跡分析，使用UHRF1抗體進行分析。β-肌動蛋白用作加載對照。選擇兩個突變克隆和一個野生型克隆，其UHRF1表達水平與野生型ESCs中內(nèi)源性UHRF1水平相似，用于后續(xù)研究。
（E）通過RRBS測序檢測的野生型和Uhrf1 Uhrf1-/-小鼠胚胎干細胞（ESCs）以及通過FLAG-Myc標記的野生型UHRF1（hUHRF1）或3KR（克隆#2）UHRF1構(gòu)建體遺傳互補的Uhrf1-/-小鼠胚胎干細胞（ESCs）中，基因區(qū)域各個部分的全局CG甲基化水平。
（F）在對照ESCs、Uhrf1 Uhrf1-/-ESCs以及穩(wěn)定表達人類野生型或3KR突變體UHRF1的Uhrf1 Uhrf1-/-ESCs中，通過亞硫酸鹽測序分析IAP和LINE1位點的DNA甲基化狀態(tài)。
（4）MOF/HDAC1介導的UHRF1乙�；瘜τ谕ㄟ^H3泛素化在DNA甲基化維持過程中高效招募DNMT1至關(guān)重要
乙酰化突變的UHRF1不能有效地招募DNMT1到異染色質(zhì)區(qū)域，導致DNA甲基化缺陷。且乙酰化突變的UHRF1顯著降低了其對組蛋白H3的E3泛素連接酶活性，進而影響DNMT1招募。
圖5：UHRF1乙�；癁榻M蛋白H3泛素化和DNMT1招募所必需
（A）在野生型Uhrf1胚胎干細胞（ESCs）、Uhrf1-/-小鼠胚胎干細胞（ESCs）以及表達FLAG-Myc標記的野生型UHRF1或3KR突變體UHRF1或ΔRING突變體UHRF1的Uhrf1-/-小鼠胚胎干細胞（ESCs）中，對Dnmt1進行免疫熒光分析。（B）來自至少三次重復實驗的代表性Western Blot分析，用于檢測野生型小鼠胚胎干細胞（ESCs）、Uhrf1-/-小鼠胚胎干細胞（ESCs）以及表達外源性人類FLAG-Myc標記的野生型UHRF1或3KR（兩個克�。┩蛔凅wUHRF1的Uhrf1-/-小鼠胚胎干細胞（ESCs）中的泛素化組蛋白H3。
（C）在HEK293T細胞中組蛋白H3.1泛素化。在存在MOF、HDAC1、MOF siRNA或HDAC1 siRNA的情況下，從HEK293T細胞中免疫沉淀的外源性FLAG-H3.1的泛素化通過Western Blot進行檢測。將裂解液進行FLAG抗體的免疫沉淀（IP），以沉淀外源性組蛋白H3.1，隨后使用FLAG和血凝素（HA）抗體進行免疫印跡分析，以檢測H3.1和HA標記的泛素。在FLAG IP樣本中顯示的HA標記的泛素反映了FLAG-H3.1的泛素化水平。
（D）在HEK293T細胞中PML4的泛素化。將HA-PML4、Myc-UHRF1和FLAG-泛素構(gòu)建體轉(zhuǎn)染到HEK293T細胞中，在有無MOF或HDAC1存在的情況下進行實驗。在收獲前6小時用5μM MG132處理細胞。將細胞裂解液進行HA抗體的免疫沉淀，以沉淀外源性表達的野生型HA-PML4，隨后使用HA、FLAG抗體進行免疫印跡分析，以檢測PML4和FLAG標記的泛素。
（5）在小鼠胚胎干細胞（ESCs）中敲低Mof會降低DNA甲基化水平。
圖6：在小鼠胚胎干細胞（ESCs）中敲低Mof會降低DNA甲基化
（A）通過穩(wěn)定表達兩種不同的KAT8短發(fā)夾RNA（shRNA），生成了兩條Mof（KAT8）敲低（KD）小鼠胚胎干細胞（ESCs）系。對野生型、Uhrf1-/-和Mof敲低小鼠胚胎干細胞（ESCs）的細胞裂解液分別用MOF和UHRF1抗體進行免疫印跡分析。（B）對野生型、Uhrf1-/-和Mof敲低小鼠胚胎干細胞（ESCs）中的5mC水平進行免疫熒光染色。對內(nèi)源性H4K16ac進行染色以反映Mof乙酰轉(zhuǎn)移酶活性。
（C）通過RRBS測序檢測的野生型和Mof敲低（clone 1）小鼠胚胎干細胞（ESCs）基因組DNA在不同基因組區(qū)域的整體CpG DNA甲基化譜。
（D）在野生型、Uhrf1-/-和穩(wěn)定敲低Mof的野生型小鼠胚胎干細胞（ESCs）中，通過亞硫酸鹽測序分析IAP和LINE1位點的DNA甲基化情況。
易小結(jié)
本研究揭示了MOF對UHRF1的乙�；揎検荄NA甲基化維持的關(guān)鍵調(diào)控機制。UHRF1的K670、K667和K668位點的乙酰化增強了其E3泛素連接酶活性，促進了組蛋白H3泛素化，從而有助于DNMT1招募和DNA甲基化維持。這一發(fā)現(xiàn)不僅為理解DNA甲基化維持的分子機制提供了新視角，還可能為相關(guān)疾病的治療提供潛在靶點。
RRBS在本研究中的作用
RRBS（Reduced Representation Bisulfite Sequencing）是一種用于分析基因組中DNA甲基化模式的技術(shù)。在本研究中，RRBS被用于分析不同基因型小鼠胚胎干細胞（包括野生型、UHRF1敲除型和表達突變UHRF1的細胞）的全基因組DNA甲基化水平。
- 單堿基分辨率檢測不同基因組區(qū)域的DNA甲基化水平，揭示UHRF1乙�；蛔儗NA甲基化維持的整體影響。
- 鑒定在不同細胞類型或處理條件下發(fā)生顯著甲基化變化的基因組區(qū)域（差異甲基化區(qū)域），為理解UHRF1在DNA甲基化維持中的作用提供了基因組學證據(jù)。
- 結(jié)合基因表達數(shù)據(jù)，分析DNA甲基化變化對基因表達的潛在影響，進一步揭示UHRF1乙�；诒碛^遺傳調(diào)控中的功能。
Xu X, Wang H, Han H, Yao Y, Li X, Qi J, Cai C, Zhou M, Tang Y, Pan T, Zhang Z, Yang J, Wu D, Han Y. Clinical characteristics and prognostic significance of DNA methylation regulatory gene mutations in acute myeloid leukemia. Clin Epigenetics. 2023 Mar 29;15(1):54. pii: 10.1186/s13148-023-01474-0. doi: 10.1186/s13148-023-01474-0.
標簽：
DNA甲基化
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