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WGBS等揭示SOX30甲基化在非梗阻性無(wú)精癥中的表觀遺傳調(diào)控機(jī)制

瀏覽次數(shù)：852　發(fā)布日期：2023-7-11　來(lái)源：本站　僅供參考，謝絕轉(zhuǎn)載，否則責(zé)任自負(fù)

不孕不育是生殖健康中非常嚴(yán)重的問(wèn)題之一。約一半不孕不育由男性因素引起，其中約15%為精液中完全沒(méi)有精子的無(wú)精癥。無(wú)精癥分為梗阻性無(wú)精癥（obstructive azoospermia，OA，約占40%）和非梗阻性無(wú)精癥（non-obstructive azoospermia，NOA，約占60%）。OA伴睪丸生精功能正常是由于排液管物理梗阻而不能產(chǎn)生成熟精子的結(jié)果； NOA是人類(lèi)男性不育最嚴(yán)重的形式，是睪丸生精異常而無(wú)法產(chǎn)生睪丸精子的結(jié)果。截至目前超過(guò)80%的NOA病因不明。

越來(lái)越多的證據(jù)表明，生殖細(xì)胞中正常的甲基化模式與男性生育力高度相關(guān)。表觀遺傳學(xué)變化是否與NOA疾病相關(guān)尚不清楚。

2020年03月06日，陸軍醫(yī)科大學(xué)（第三軍醫(yī)大學(xué)）預(yù)防醫(yī)學(xué)院毒理學(xué)研究所韓飛教授等為第一作者，曹佳教授、劉晉祎教授為通訊作者以"Epigenetic Inactivation of SOX30 Is Associated with Male Infertility and Offers a Therapy Target for Non-obstructive Azoospermia"為題在《Mol Ther Nucleic Acids》雜志發(fā)表研究論文。該研究通過(guò)對(duì)OA和NOA患者之間的睪丸活檢標(biāo)本中的DNA甲基化進(jìn)行全基因組比較分析，鑒定出SOX30為不孕不育的關(guān)鍵男性特異性因子，為人類(lèi)NOA疾病的治療提供了前瞻性靶點(diǎn)。

標(biāo)題：Epigenetic Inactivation of SOX30 Is Associated with Male Infertility and Offers a Therapy Target for Non-obstructive Azoospermia（SOX30的表觀遺傳失活與男性不育有關(guān)，并為非梗阻性無(wú)精癥提供了治療靶點(diǎn)）
發(fā)表期刊：Molecular Therapy-Nucleic Acids
發(fā)表日期：2020年03月06日
影響因子：IF 8.8
技術(shù)：全基因組重亞硫酸鹽測(cè)序（WGBS）等

樣品：
睪丸活檢標(biāo)本取自O(shè)A和NOA患者（排除既往有睪丸損傷的患者）
OA對(duì)照組：從326名OA患者中選擇15名年齡在20-42歲的OA男性作為對(duì)照組織
NOA測(cè)試組：從176名NOA患者中選擇58名年齡在20-45歲的NOA男性，包括31例無(wú)精子（spermatozoa）NOA患者（NOA-I）、22例無(wú)精細(xì)胞（spermatid）患者（NOA-II）和5例無(wú)精母細(xì)胞（spermatocyte）NOA患者（NOA-III），提取DNA進(jìn)行DNA甲基化分析

摘要
非梗阻性無(wú)精癥（NOA）是最嚴(yán)重的男性不育形式，然而NOA病因尚不清楚，導(dǎo)致缺乏臨床治療。本研究對(duì)NOA患者的DNA甲基化進(jìn)行了全基因組比較分析，并將SOX30鑒定為NOA患者睪丸組織中啟動(dòng)子區(qū)域最顯著的高甲基化基因。SOX30啟動(dòng)子高甲基化直接導(dǎo)致其在NOA中表達(dá)沉默，SOX30表達(dá)水平下調(diào)與NOA疾病嚴(yán)重程度相關(guān)。小鼠中Sox30缺失特異性的影響睪丸發(fā)育和精子發(fā)生，導(dǎo)致睪丸中完全沒(méi)有精子，從而導(dǎo)致男性不育，但不影響卵巢發(fā)育和女性生育力。Sox30缺失小鼠模型的病理學(xué)和睪丸大小與NOA患者高度相似，成年期Sox30缺失小鼠中Sox30重新表達(dá)可逆轉(zhuǎn)睪丸病理?yè)p傷并恢復(fù)精子發(fā)生。在Sox30缺失小鼠中重新表達(dá)Sox30后，重新發(fā)生的精子具有開(kāi)始妊娠的能力。此外，Sox30重新表達(dá)的Sox30缺失小鼠的雄性后代仍能生育，這些雄性后代及其子代可以正常生活1年以上，且體貌與野生型小鼠相比無(wú)顯著差異。綜上所述，SOX30甲基化失活會(huì)特異性影響精子發(fā)生，可能導(dǎo)致NOA疾病，而SOX30重新表達(dá)可以成功恢復(fù)精子發(fā)生和實(shí)際生育力。本研究進(jìn)一步加深了對(duì)NOA發(fā)病機(jī)制的理解，為NOA疾病的治療提供了一個(gè)有希望的靶點(diǎn)。

圖形摘要：SOX30與人類(lèi)NOA疾病發(fā)展示意圖
在出生后睪丸中，當(dāng)啟動(dòng)子未甲基化時(shí)，SOX30高表達(dá)，精子發(fā)生正常。當(dāng)啟動(dòng)子高甲基化時(shí)，SOX30表達(dá)沉默，精子發(fā)生受限，NOA疾病發(fā)展。

研究結(jié)果：
（1）SOX30在NOA患者的睪丸組織中高甲基化

圖1：SOX30被鑒定為NOA睪丸組織中的高甲基化基因

與OA睪丸組織相比，NOA睪丸組織中不同基因區(qū)域的DNA甲基化水平。箭頭表示NOA中的高甲基化區(qū)域。
通過(guò)全基因組DNA甲基化分析，將SOX30鑒定為NOA樣品中5號(hào)染色體（Chr5）上的優(yōu)先甲基化基因。Circos圖顯示OA和NOA樣品中的Chr5甲基化模式。染色體區(qū)、GC水平，重復(fù)序列水平、基因序列水平、OA樣本甲基化水平和NOA樣本甲基化水平在Circos圖中由外到內(nèi)依次顯示。箭頭表示NOA樣品中SOX30基因的優(yōu)先甲基化位點(diǎn)。橙色框代表SOX30啟動(dòng)子。與SOX30表達(dá)負(fù)相關(guān)的高甲基化CpG位點(diǎn)用紅色箭頭表示。
NOA和OA患者的其他獨(dú)立睪丸組織樣本中SOX30差異甲基化位點(diǎn)的分層聚類(lèi)。關(guān)鍵顏色條表示甲基化水平。NOA-S1、NOA-S2、NOA-S3、OA-S1、OA-S2和OA-S3分別代表NOA-Sample1、NOA-Sample2、NOA-Sample3、OA-Sample1、OA-Sample2和OA-Sample3。

表1：OA和NOA患者睪丸組織中的3號(hào)染色體、18號(hào)染色體和5號(hào)染色體啟動(dòng)子區(qū)DMR的高甲基化基因

（2）SOX30啟動(dòng)子高甲基化沉默與NOA高度相關(guān)

圖2：通過(guò)高甲基化沉默的SOX30與NOA密切相關(guān)

三例OA（OA-S1，-S2，-S3）患者和三例NOA（NOA-S1，-S2，-S3）患者睪丸組織中差異表達(dá)基因（≥2倍）的分層聚類(lèi)分析，以及SOX30作為NOA患者優(yōu)先沉默基因的鑒定。顏色條表示mRNA表達(dá)水平。
在OA和NOA患者的睪丸活檢標(biāo)本中進(jìn)行SOX30的IHC染色。NOA-I、NOA-II和NOA-III分別代表無(wú)精子的NOA患者，無(wú)精細(xì)胞的NOA患者和無(wú)精母細(xì)胞的NOA患者。箭頭代表精子、精子細(xì)胞和精母細(xì)胞。標(biāo)尺代表20μm。
在OA和NOA患者的睪丸活檢標(biāo)本中定量檢測(cè)SOX30的IHC染色，****p＜0.0001。

（3）Sox30基因缺失會(huì)特異性的影響睪丸發(fā)育和精子發(fā)生，導(dǎo)致不育

圖3：Sox30是男性生育和睪丸發(fā)育所必需的基因

分析不同Sox30基因型小鼠的生育力。+/+代表野生型小鼠（Sox30），-/+代表雜合小鼠（Sox30+/+-/+），-/-代表純合小鼠（Sox30-/-）。
qRT-PCR和WB分析Sox30在具有指定基因型小鼠睪丸中的表達(dá)**p＜0.01。β-肌動(dòng)蛋白用作內(nèi)部對(duì)照。
在Sox30、Sox30+/+-/+和Sox30-/-小鼠中分別分析睪丸的形態(tài)和重量（Sox30:n=15，Sox30+/+-/+：n=19，Sox30-/-:n=14）**p＜0.01。
比較Sox30-/-小鼠在不同發(fā)育階段（出生后40天、120天和180天[dpp]）的睪丸重量**p＜0.01。
從5個(gè)月以上的Sox30（n=10）、Sox30+/+-/+（n=10）和Sox30-/-（n=10）小鼠中顯示附睪和睪丸切片的H＆E染色。附睪中的箭頭表示精子。睪丸中的箭頭表示精子和精細(xì)胞。

（4）Sox30-/-小鼠模型的病理學(xué)和睪丸大小與NOA患者相似

圖4：Sox30-/-小鼠模型的病理學(xué)和睪丸大小與NOA患者相似

比較人NOA患者和Sox30-/-小鼠在6個(gè)月（n=10）和8個(gè)月（n=8）發(fā)育時(shí)期睪丸的H＆E染色。在6個(gè)月大的Sox30缺失小鼠中，幾乎僅觀察到精母細(xì)胞樣細(xì)胞、精原細(xì)胞和支持細(xì)胞。在8個(gè)月大的Sox30缺失小鼠中觀察到一些精母細(xì)胞樣細(xì)胞，幾乎只有精原細(xì)胞和支持細(xì)胞。
比較不同年齡NOA患者的睪丸體積。NOA-II+III（≤30）表示≤30歲的NOA-II和NOA-III患者，NOA-II+III（>30）代表＞30歲的NOA-II和NOA-III患者。
比較OA和NOA患者的睪丸體積****p＜0.0001。

（5）Sox30缺失導(dǎo)致的不孕癥可通過(guò)Sox30重新表達(dá)來(lái)恢復(fù)生育力

圖5：Sox30-/-小鼠的不育可以通過(guò)Sox30的重新表達(dá)來(lái)恢復(fù)

Sox30、Sox30+/+-/-和Sox30重新表達(dá)的Sox30-/-（Sox30loxp/loxp）小鼠的睪丸和附睪的H＆E染色。
在Sox30-/-小鼠中重新表達(dá)Sox30后，通過(guò)生育力分析評(píng)估重新發(fā)生的精子的生育力。
在Sox30（n=5）、Sox30+/+-/-（n=8）和Sox30loxp/loxp（n=14）小鼠中分析睪丸的重量。

圖6：不同基因型小鼠睪丸的病理形態(tài)

Sox30\Sox30+/+-/-和Sox30重新表達(dá)的Sox30-/-（Sox30loxp/loxp）小鼠的睪丸和附睪的H＆E染色。
B-C. Sox30、Sox30+/+-/-和Sox30loxp/loxp小鼠睪丸中Sox30表達(dá)的qRT-PCR（B）和WB（C）分析***p＜0.001。β-肌動(dòng)蛋白用作內(nèi)部對(duì)照。

易基因小結(jié)：
本研究通過(guò)對(duì)OA和NOA患者睪丸活檢標(biāo)本的全基因組重亞硫酸鹽測(cè)序（WGBS）分析，揭示了SOX30的甲基化失活會(huì)特異性地影響睪丸發(fā)育和精子發(fā)生，可能導(dǎo)致NOA疾病，SOX30重新表達(dá)可以成功恢復(fù)精子發(fā)生和實(shí)際生育能力。本研究為人類(lèi)NOA疾病提供了重要的治療靶點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)：
Han F, Jiang X, Li ZM, Zhuang X, Zhang X, Ouyang WM, Liu WB, Mao CY, Chen Q, Huang CS, Gao F, Cui ZH, Ao L, Li YF, Cao J, Liu JY. Epigenetic Inactivation of SOX30 Is Associated with Male Infertility and Offers a Therapy Target for Non-obstructive Azoospermia. Mol Ther Nucleic Acids. 2020 Mar 6;19:72-83.

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