在醫(yī)學(xué)診斷領(lǐng)域，如何實(shí)現(xiàn)對(duì)生物組織的高分辨率、無創(chuàng)實(shí)時(shí)成像始終是科學(xué)家們追求的目標(biāo)。傳統(tǒng)病理學(xué)依賴組織切片與染色技術(shù)，不僅耗時(shí)且存在取樣誤差，難以滿足臨床對(duì)早期病變精準(zhǔn)診斷的需求。多光子顯微技術(shù)（MPM）的誕生，為這一難題提供了革命性解決方案。MPM基于飛秒激光與生物組織內(nèi)源性成分的非線性光學(xué)效應(yīng)，通過探測(cè)雙光子激發(fā)熒光（TPEF）和二次諧波（SHG）信號(hào)，可實(shí)現(xiàn)組織的三維、無標(biāo)記成像。

近年來，MPM在消化道腫瘤、皮膚疾病及角膜病變?cè)\斷中展現(xiàn)出獨(dú)特價(jià)值。例如，通過量化膠原纖維排列紊亂程度和細(xì)胞代謝活性，MPM能有效區(qū)分正常組織、癌前病變與浸潤(rùn)性腫瘤。本文將從技術(shù)原理、應(yīng)用突破及臨床轉(zhuǎn)化挑戰(zhàn)等多維度，系統(tǒng)解析MPM如何重塑現(xiàn)代醫(yī)學(xué)診斷的邊界。

研究背景與技術(shù)挑戰(zhàn)
傳統(tǒng)診斷技術(shù)的局限性
組織病理學(xué)作為疾病診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，依賴活檢樣本的固定、切片與染色處理，流程繁瑣且無法實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)動(dòng)態(tài)病變。共聚焦顯微技術(shù)雖能實(shí)現(xiàn)活體成像，但受限于單光子激發(fā)機(jī)制，存在成像深度淺、光損傷大等問題，難以應(yīng)用于皮膚真皮層或消化道黏膜下層的深層病變檢測(cè)。

技術(shù)創(chuàng)新與應(yīng)用
消化道腫瘤的精準(zhǔn)分層診斷
MPM在胃腸腫瘤診斷中的核心價(jià)值在于實(shí)現(xiàn)原位病理可視化。通過分析隱窩結(jié)構(gòu)形態(tài)、基底膜完整性及細(xì)胞氧化還原比，MPM可清晰區(qū)分正常黏膜、非浸潤(rùn)性瘤變與浸潤(rùn)性癌灶。正常結(jié)腸黏膜的隱窩呈規(guī)則蜂窩狀排列，基底膜連續(xù)完整，氧化還原比均值為1.82；非浸潤(rùn)性瘤變的隱窩扭曲拉長(zhǎng)，基底膜管狀擴(kuò)張，氧化還原比升至2.57；浸潤(rùn)性癌灶的隱窩結(jié)構(gòu)完全破壞，基底膜斷裂消失，氧化還原比進(jìn)一步升高至3.26。這種基于內(nèi)源性標(biāo)志物的定量分層，為內(nèi)鏡下實(shí)時(shí)判斷腫瘤進(jìn)展提供了新范式。

皮膚光老化的無創(chuàng)定量評(píng)估
MPM通過雙通道信號(hào)構(gòu)建皮膚老化指數(shù)，可無創(chuàng)量化真皮層膠原-彈性纖維比例。年輕皮膚的膠原纖維致密，老化指數(shù)值接近+0.5；光老化皮膚的彈性纖維增生取代膠原，指數(shù)值降至-0.93。該技術(shù)還可識(shí)別基底細(xì)胞癌的邊界：癌灶區(qū)二次諧波信號(hào)缺失，雙光子熒光顯示密集的腫瘤細(xì)胞團(tuán)，與周圍正常真皮形成鮮明對(duì)比。

角膜病變的微結(jié)構(gòu)解析
作為首個(gè)實(shí)現(xiàn)全角膜成像的技術(shù)，MPM突破角膜透明性對(duì)傳統(tǒng)顯微成像的限制。在感染性角膜炎模型中，二次諧波信號(hào)揭示膠原纖維破壞程度，雙光子熒光直接顯示病原體形態(tài)；在圓錐角膜中，成像技術(shù)捕捉膠原層異常重組，角膜細(xì)胞沿紊亂纖維呈紡錘狀排列；對(duì)于屈光術(shù)后瘢痕，該技術(shù)可動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)角膜混濁的形成與藥物干預(yù)效果。

成像實(shí)驗(yàn)與結(jié)果分析
消化道腫瘤的形態(tài)-功能雙模態(tài)成像
通過對(duì)離體食管、胃及結(jié)腸樣本的成像研究，發(fā)現(xiàn)癌變組織的二次諧波信號(hào)強(qiáng)度較正常組織下降40%-60%，反映膠原降解；而雙光子熒光信號(hào)在癌灶邊緣增強(qiáng)2-3倍，提示代謝活躍的腫瘤細(xì)胞增殖�？v向剖面成像顯示，浸潤(rùn)性癌灶的基底膜呈蟲蝕樣斷裂，與病理切片結(jié)果高度吻合。

角膜病理的層析成像驗(yàn)證
在感染性角膜炎模型中，成像深度達(dá)角膜全層，二次諧波信號(hào)缺失區(qū)域與臨床診斷的潰瘍范圍一致。對(duì)圓錐角膜的前向與背向信號(hào)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，前向模式更易識(shí)別纖維走向紊亂，而背向模式更適合臨床原位檢查。

總結(jié)與展望
多光子顯微技術(shù)憑借其無創(chuàng)、高分辨、多模態(tài)成像的優(yōu)勢(shì)，正在重塑疾病診斷的技術(shù)范式。在消化道腫瘤領(lǐng)域，該技術(shù)通過量化隱窩結(jié)構(gòu)異變、基底膜完整性及細(xì)胞代謝活性，為早期癌變篩查提供了超越傳統(tǒng)病理的敏感指標(biāo)；在皮膚科學(xué)中，老化指數(shù)實(shí)現(xiàn)了光老化的客觀分級(jí)與皮膚癌的邊界界定；在眼科領(lǐng)域，該技術(shù)首次實(shí)現(xiàn)全角膜膠原網(wǎng)絡(luò)的可視化，為感染性角膜炎與屈光術(shù)后并發(fā)癥的精準(zhǔn)管理奠定基礎(chǔ)。隨著固態(tài)飛秒激光器與人工智能技術(shù)的融合，該技術(shù)有望成為手術(shù)導(dǎo)航、病理活檢定位的實(shí)時(shí)決策工具，推動(dòng)醫(yī)學(xué)診斷從組織切片時(shí)代邁向活體成像時(shí)代。

論文信息
聲明：本文僅用作學(xué)術(shù)目的。
林宏心, 左寧, 卓雙木, 陳建新. 多光子顯微技術(shù)在醫(yī)學(xué)診斷中的應(yīng)用[J]. 中國(guó)激光, 2018, 45(2): 0207014.

DOI:10.3788/CJL201845.0207014.