近日，倫敦帝國(guó)理工學(xué)院抗菌藥物優(yōu)化中心，倫敦衛(wèi)生和熱帶醫(yī)學(xué)學(xué)院傳染病和熱帶病學(xué)院Alaa Riezk et al.研究團(tuán)隊(duì)，利用英國(guó)Kirkstall 3D 活細(xì)胞自動(dòng)灌流培養(yǎng)系統(tǒng)模擬生理流體流動(dòng)，對(duì)比了靜態(tài)和動(dòng)態(tài)培養(yǎng)條件下巨噬細(xì)胞的反應(yīng)及抗利什曼原蟲納米藥物的療效，強(qiáng)調(diào)了流體流動(dòng)動(dòng)力學(xué)在體外研究中的重要性，為皮膚利什曼病治療策略的優(yōu)化提供了參考。

 一. 研究背景：
利什曼病是由利什曼原蟲引起的寄生蟲病，包括內(nèi)臟利什曼病和皮膚利什曼病等，現(xiàn)有治療手段存在局限且新藥研發(fā)不足。傳統(tǒng)靜態(tài)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)無(wú)法模擬體內(nèi)動(dòng)態(tài)環(huán)境，而動(dòng)態(tài)培養(yǎng)系統(tǒng)能更好地模擬細(xì)胞在體內(nèi)的生理?xiàng)l件，有助于更準(zhǔn)確地研究細(xì)胞行為和病原體相互作用。本研究旨在探究Kirkstall 3D 活細(xì)胞自動(dòng)灌流培養(yǎng)系統(tǒng) 模擬的動(dòng)態(tài)流體灌注，對(duì)巨噬細(xì)胞功能及基于殼聚糖的抗利什曼原蟲制劑療效的影響。



 二. 主要實(shí)驗(yàn)儀器/關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)步驟描述：
 1. 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備階段    
 1.1 選擇實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)：選用英國(guó)Kirkstall QV介質(zhì)灌注系統(tǒng)，其六腔光學(xué)托盤可實(shí)現(xiàn)細(xì)胞在不同介質(zhì)灌注速率下的培養(yǎng)，且能直接觀察感染細(xì)胞并持續(xù)監(jiān)測(cè)感染情況。為模擬人體間質(zhì)液條件，通過(guò)數(shù)學(xué)和計(jì)算模型確定插入塊高度，以確保細(xì)胞表面流速符合皮膚間質(zhì)液流速范圍。實(shí)驗(yàn)設(shè)置了靜態(tài)（0 m/s）、慢速（\(1.45×10^{-9}m/s\) ，細(xì)胞位于腔室底部）和快速（\(1.23×10^{-7}m/s\) ，細(xì)胞位于插入塊上）三種流動(dòng)條件   
1.2細(xì)胞與寄生蟲培養(yǎng)：利什曼原蟲（L. major，MHOM/SA/85/JISH118）的無(wú)鞭毛體從感染小鼠皮膚損傷處分離并轉(zhuǎn)化為前鞭毛體，在添加10%熱滅活胎牛血清（HiFCS）的Schneider昆蟲培養(yǎng)基中于26°C培養(yǎng)，定期通過(guò)BALB/c小鼠傳代，實(shí)驗(yàn)使用低代數(shù)（<3代）前鞭毛體。從6 - 8周齡雌性BALB/c小鼠獲取骨髓來(lái)源的巨噬細(xì)胞（BMMs） ，從8 - 10周齡雌性CD1小鼠獲取腹腔巨噬細(xì)胞（PEMs） 。THP - 1細(xì)胞在添加L - 谷氨酰胺和10% HiFCS的RPMI - 1640培養(yǎng)基中，于37°C、5% \(CO_2\) 培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每周按1/10比例傳代，用20 ng/mL佛波酯12 - 肉豆蔻酸13 - 乙酸酯（PMA）處理24小時(shí)誘導(dǎo)分化為巨噬細(xì)胞。  
2. 感染巨噬細(xì)胞：將巨噬細(xì)胞（PEMs、BMMs、THP - 1細(xì)胞）以每孔\(4×10^5\) 個(gè)細(xì)胞的密度接種在24孔板的12mm圓形玻璃蓋玻片上，在RPMI - 1640培養(yǎng)基（含10% HiFCS）中于37°C、5% \(CO_2\) 孵育24小時(shí)。之后，加入不同濃度的L. major前鞭毛體（使寄生蟲與巨噬細(xì)胞比例在0.5:1至15:1之間），在34°C、5% \(CO_2\) 環(huán)境下繼續(xù)孵育24小時(shí)。隨后，將三分之二的玻璃蓋玻片轉(zhuǎn)移至QV900系統(tǒng)進(jìn)行動(dòng)態(tài)培養(yǎng)，其余作為靜態(tài)對(duì)照，在相同溫度和\(CO_2\) 濃度下繼續(xù)培養(yǎng)72小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，用甲醇固定細(xì)胞，并用吉姆薩染色 。 


3. 測(cè)量巨噬細(xì)胞功能  
3.1吞噬作用：利用2μm直徑的熒光紅色標(biāo)記乳膠珠評(píng)估巨噬細(xì)胞的吞噬作用。巨噬細(xì)胞感染L. major前鞭毛體并在不同流動(dòng)條件下孵育0.5 - 24小時(shí)后，用冰冷PBS洗滌去除未內(nèi)化的珠子，再用0.5% Triton X - 100和0.2 M NaOH裂解細(xì)胞。通過(guò)熒光酶標(biāo)儀（激發(fā)波長(zhǎng)575nm，發(fā)射波長(zhǎng)610nm）分析細(xì)胞裂解物，以確定吞噬的乳膠珠數(shù)量，并根據(jù)細(xì)胞蛋白含量（使用Micro BCA蛋白試劑盒測(cè)定）進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。實(shí)驗(yàn)設(shè)置了細(xì)胞松弛素D（1μg/ml）抑制吞噬作用的對(duì)照組 。    
 3.2巨胞飲作用：采用pHrodo Red葡聚糖（在酸性環(huán)境中發(fā)熒光）測(cè)量巨噬細(xì)胞的巨胞飲作用。巨噬細(xì)胞感染寄生蟲后在不同流動(dòng)條件下培養(yǎng)，用Live Cell Imaging Solution洗滌三次，然后在含10% HiFCS和40μg/mL pHrodo Red葡聚糖的RPMI - 1640培養(yǎng)基中于34°C、5% \(CO_2\) 孵育0.5 - 24小時(shí)。孵育結(jié)束后再次洗滌細(xì)胞，用熒光酶標(biāo)儀（激發(fā)波長(zhǎng)560nm，發(fā)射波長(zhǎng)585nm）檢測(cè)巨胞飲活性。實(shí)驗(yàn)使用10μg/ml丙嗪（已知的巨胞飲抑制劑）孵育巨噬細(xì)胞2小時(shí)，以抑制巨胞飲作用，作為對(duì)照組 。
 4. 藥物和納米顆粒的制備與表征   
4.1藥物和納米顆粒制備：兩性霉素B（AmB，純度≥95%）用DMSO溶解配制成10mM儲(chǔ)存液，再稀釋于含10%HiFCS的RPMI - 1640培養(yǎng)基中備用。取1g高分子量殼聚糖（MW = 310 - 375kDa）溶解于100mL 1%溶液，室溫?cái)嚢?4小時(shí)至澄清，用2M氫調(diào)節(jié)pH至6.5。制備納米顆粒時(shí)，在攪拌條件下，向10mL殼聚糖溶液中逐滴加入10mL TPP水溶液（制備空白納米顆粒不加AmB，制備載藥納米顆粒則加入0.5mL AmB），攪拌5分鐘后超聲15分鐘以減小粒徑，再通過(guò)0.2µm注射器過(guò)濾器過(guò)濾去除聚集體和較大顆粒，然后用30kDa離心過(guò)濾器（Spin - X UF concentrators）離心純化和濃縮，去除未包裹的AmB，最后加入5%蔗糖作為冷凍保護(hù)劑進(jìn)行凍干，48小時(shí)后收集凍干的納米顆粒并儲(chǔ)存于4°C 。     
4.2藥物和納米顆粒表征：通過(guò)高效液相色譜（HPLC）分析AmB，計(jì)算包封率（EE）和藥物負(fù)載量。公式分別為：EE（%） = 100×（總AmB重量 - 游離AmB重量）/總AmB重量；藥物負(fù)載量（%） = 100×（總AmB重量 - 游離AmB重量）/（殼聚糖重量 + TPP重量） 。使用ZetaSizer測(cè)量納米顆粒的平均直徑、zeta電位和多分散指數(shù)，用Malvern ZetaSizer軟件v7.11進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。 

5. 評(píng)估介質(zhì)流動(dòng)對(duì)藥物和納米顆粒療效的影響：將PEMs接種在玻璃蓋玻片上，在靜態(tài)條件下感染前鞭毛體24小時(shí)。之后，將三分之二含有感染巨噬細(xì)胞的蓋玻片轉(zhuǎn)移至QV900系統(tǒng)，在34°C、5% \(CO_2\) 培養(yǎng)箱中以360μL/min的流速進(jìn)行動(dòng)態(tài)培養(yǎng)，分別設(shè)置細(xì)胞位于腔室底部（慢速流動(dòng)，\(1.45×10^{-9}m/s\) ）和位于插入塊上（快速流動(dòng)，\(1.23×10^{-7}m/s\) ）兩種情況，其余蓋玻片作為靜態(tài)對(duì)照。在靜態(tài)感染24小時(shí)后，用于藥物活性研究的培養(yǎng)基中添加不同濃度的藥物（殼聚糖溶液、空白殼聚糖 - TPP納米顆粒、載藥AmB的殼聚糖 - TPP納米顆粒、純AmB）。72小時(shí)后，取出所有蓋玻片，用甲醇固定、吉姆薩染色，在顯微鏡下計(jì)數(shù)感染巨噬細(xì)胞數(shù)量，評(píng)估藥物對(duì)寄生蟲感染的抑制效果，使用Prism軟件（GraphPad）進(jìn)行非線性S型曲線擬合（可變斜率）分析數(shù)據(jù) 。 



三. 研究結(jié)果
- 巨噬細(xì)胞功能：感染L. major的巨噬細(xì)胞（PEMs、BMMs和THP - 1）的吞噬和巨胞飲作用比未感染細(xì)胞顯著增強(qiáng)，且PEMs和BMMs的這兩種功能高于THP - 1細(xì)胞。動(dòng)態(tài)流動(dòng)條件下，巨噬細(xì)胞的吞噬和巨胞飲作用顯著降低，且流速越快，降低越明顯。     
- 抗利什曼原蟲活性：所有制劑在靜態(tài)培養(yǎng)中的抗利什曼原蟲活性均高于動(dòng)態(tài)培養(yǎng)。隨著流速增加，殼聚糖溶液、空白殼聚糖 - TPP納米顆粒、載藥AmB的殼聚糖 - TPP納米顆粒以及純AmB的抗利什曼原蟲活性均顯著下降 。流體流動(dòng)動(dòng)力學(xué)對(duì)評(píng)估巨噬細(xì)胞功能和抗利什曼原蟲活性至關(guān)重要。流體流動(dòng)會(huì)降低巨噬細(xì)胞的吞噬和巨胞飲功能，減少藥物積累，進(jìn)而降低抗利什曼原蟲藥物的療效。未來(lái)研究應(yīng)進(jìn)一步探索流體流動(dòng)對(duì)巨噬細(xì)胞行為的影響，以完善疾病機(jī)制研究和治療策略的開發(fā)。 
參考文獻(xiàn)：Comparative assessment of macrophage responses and antileishmanial efficacy in dynamic vs. Static culture systems utilizing chitosan-based formulations,Published: March 11, 2025

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