免疫熒光技術(shù)實驗技巧匯總
免疫熒光技術(shù)是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理，先將已知的抗原或抗體標(biāo)記上熒光素，制成熒光抗體，再用這種熒光抗體（或抗原）作為探針檢測組織或細(xì)胞內(nèi)的相應(yīng)抗原（或抗體）。在組織或細(xì)胞內(nèi)形成的抗原抗體復(fù)合物上含有標(biāo)記的熒光素，利用熒光顯微鏡觀察標(biāo)本，熒光素受外來激發(fā)光的照射而發(fā)生明亮的熒光（黃綠色或橘紅色），可以看見熒光所在的組織細(xì)胞，從而確定抗原或抗體的性質(zhì)、定位，以及利用定量技術(shù)測定含量。
免疫熒光步驟包括，細(xì)胞固定和通透，封閉，孵育一抗，二抗等。除了這些基本步驟，接下來的實驗技巧方法如下：
1. 細(xì)胞固定和通透
為達(dá)到蕞佳的檢測效果，細(xì)胞需要經(jīng)過固定和通透。步驟很重要，細(xì)胞和抗原需要保證蕞佳的結(jié)構(gòu)，并利于抗體與抗原結(jié)合。通常情況下，
2. 抗體特異性
免疫熒光需要用到特異性非常強(qiáng)的抗體，可以避免高背景和不理想的蛋白定位結(jié)果。在大多數(shù)情況下，純化抗體的效果很好，但是正確的對照可以幫助精-準(zhǔn)定位抗原。使用只有二抗染色的片子作為陰性對照，有利于減少降低背景干擾。
3. 合適的抗體稀釋比例
通過優(yōu)化抗體稀釋比例來優(yōu)化染色，通常情況下 1ug/ml 的純化抗體或者 1:100-1:1000 的抗血清足夠達(dá)到特異性染色的結(jié)果。但在能保證低背景染色的前提下，可以通過增加濃度來提高信號強(qiáng)度。如果是第1次使用該抗體或測定某抗原，強(qiáng)烈建議濃度梯度實驗。
4. 優(yōu)化緩沖液和封閉劑
盡管很多抗原在常見的 Buffer 如 PBS 中可以很好的被染色，但是對于某些目的抗原，更換一下含有不同離子的緩沖液，比如鈣、鎂、鉀等，可以帶來很大程度上的改善。Rockland 可提供優(yōu)化過的 IHC 用封閉緩沖液，同樣適用于熒光染色實驗。
5. 選擇正確的二抗
如果您需要做免疫實驗，我們強(qiáng)烈建議您選擇進(jìn)行過預(yù)吸附的二抗進(jìn)行單染實驗；如果是雙重甚至是多重染色，那么必須使用預(yù)吸附的二抗。同時，請優(yōu)先選擇來自同一物種的二抗。
6. 使用合適的細(xì)胞密度
選擇合適的細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行染色，當(dāng)細(xì)胞數(shù)量過多時，細(xì)胞結(jié)構(gòu)不好，導(dǎo)致染色背景深，低細(xì)胞密度，會使細(xì)胞貼壁不佳，狀態(tài)不好。
7. 多重染色
對同一樣本進(jìn)行兩個不同抗原的檢測時，可以用各自的抗體進(jìn)行同時染色，但要求兩個一抗的種屬來源不同，標(biāo)記物不同，而二抗的種屬來源需保持一致。
8. 降低背景
高背景是免疫熒光常見的問題，解決此問題可以用二抗來源的正常血清代替 BSA 做封閉液，降低抗體濃度，增加洗滌次數(shù)，洗滌至少三次，每次五分鐘，洗滌液為 PBS+0.05%Tween。
9. 封片
作為免疫熒光的蕞后一步，可以提高折射率，保護(hù)樣品。
10. 數(shù)據(jù)分析
觀察整體樣片時，選擇具有代表性的細(xì)胞進(jìn)行數(shù)據(jù)獲取與分析。
以上就是免疫熒光檢測的 10 種技巧方法，希望可以更好的服務(wù)于您的實驗，為您的實驗保駕護(hù)航！
免疫熒光步驟包括，細(xì)胞固定和通透，封閉，孵育一抗，二抗等。除了這些基本步驟，接下來的實驗技巧方法如下：
1. 細(xì)胞固定和通透
為達(dá)到蕞佳的檢測效果，細(xì)胞需要經(jīng)過固定和通透。步驟很重要，細(xì)胞和抗原需要保證蕞佳的結(jié)構(gòu)，并利于抗體與抗原結(jié)合。通常情況下，
2. 抗體特異性
免疫熒光需要用到特異性非常強(qiáng)的抗體，可以避免高背景和不理想的蛋白定位結(jié)果。在大多數(shù)情況下，純化抗體的效果很好，但是正確的對照可以幫助精-準(zhǔn)定位抗原。使用只有二抗染色的片子作為陰性對照，有利于減少降低背景干擾。
3. 合適的抗體稀釋比例
通過優(yōu)化抗體稀釋比例來優(yōu)化染色，通常情況下 1ug/ml 的純化抗體或者 1:100-1:1000 的抗血清足夠達(dá)到特異性染色的結(jié)果。但在能保證低背景染色的前提下，可以通過增加濃度來提高信號強(qiáng)度。如果是第1次使用該抗體或測定某抗原，強(qiáng)烈建議濃度梯度實驗。
4. 優(yōu)化緩沖液和封閉劑
盡管很多抗原在常見的 Buffer 如 PBS 中可以很好的被染色，但是對于某些目的抗原，更換一下含有不同離子的緩沖液，比如鈣、鎂、鉀等，可以帶來很大程度上的改善。Rockland 可提供優(yōu)化過的 IHC 用封閉緩沖液，同樣適用于熒光染色實驗。
5. 選擇正確的二抗
如果您需要做免疫實驗，我們強(qiáng)烈建議您選擇進(jìn)行過預(yù)吸附的二抗進(jìn)行單染實驗；如果是雙重甚至是多重染色，那么必須使用預(yù)吸附的二抗。同時，請優(yōu)先選擇來自同一物種的二抗。
6. 使用合適的細(xì)胞密度
選擇合適的細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行染色，當(dāng)細(xì)胞數(shù)量過多時，細(xì)胞結(jié)構(gòu)不好，導(dǎo)致染色背景深，低細(xì)胞密度，會使細(xì)胞貼壁不佳，狀態(tài)不好。
7. 多重染色
對同一樣本進(jìn)行兩個不同抗原的檢測時，可以用各自的抗體進(jìn)行同時染色，但要求兩個一抗的種屬來源不同，標(biāo)記物不同，而二抗的種屬來源需保持一致。
8. 降低背景
高背景是免疫熒光常見的問題，解決此問題可以用二抗來源的正常血清代替 BSA 做封閉液，降低抗體濃度，增加洗滌次數(shù)，洗滌至少三次，每次五分鐘，洗滌液為 PBS+0.05%Tween。
9. 封片
作為免疫熒光的蕞后一步，可以提高折射率，保護(hù)樣品。
10. 數(shù)據(jù)分析
觀察整體樣片時，選擇具有代表性的細(xì)胞進(jìn)行數(shù)據(jù)獲取與分析。
以上就是免疫熒光檢測的 10 種技巧方法，希望可以更好的服務(wù)于您的實驗，為您的實驗保駕護(hù)航！
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