PCR實驗前的準備及循環(huán)步驟詳解
一、PCR實驗前的準備
在開始PCR實驗之前，必須準備好DNA模板（基因組DNA或逆轉錄制備的cDNA）、特異性引物（自己設計或用軟件設計），并選擇合適的商業(yè)酶（選擇符合您實驗目的的酶)
1.DNA聚合酶。有許多商業(yè) DNA 聚合酶，它們具有不同的特性。一般分為兩類：高保真聚合酶和普通Taq聚合酶。如果您想對沒有任何突變的特定 DNA 片段進行 PCR，請選擇高保真聚合酶。如果只是想檢測特定序列的存在，就選擇普通的Taq聚合酶。如果要對T-vector連接的片段進行PCR，要注意，因為大多數(shù)高保真聚合酶的產(chǎn)物都沒有A-tailing，所以應該選擇普通的Taq聚合酶或在PCR實驗后添加A-tailing。
2.引物的特異性影響 PCR 成功的概率，良好的引物設計對 PCR 擴增的成功至關重要。當您開始設計引物時，應仔細考慮以下幾個原則：
①引物的長度。PCR引物一般在18-22bp左右。這對于引物特異性和在退火溫度下的結合來說是足夠長的。
②熔化溫度(Tm)。Tm 定義為在此溫度下，DNA 雙鏈體的一半將解離成單鏈 DNA。52-58C 范圍內的引物 Tm 是最佳的。
③GC 含量。最佳 GC 含量應為 40-60%。
④許多軟件可用于引物設計，例如primer5和Oligo。這些軟件推薦的引物通�？梢詽M足我們的需求。
二、實驗步驟：
根據(jù)PCR使用說明進行試劑混合預配，并設置 PCR 循環(huán)。
簡而言之，PCR需要經(jīng)過以下循環(huán)：
1.初始化步驟。這僅對熱啟動 PCR 必不可少。此步驟將溶液加熱至 94-98°C，以激活 DNA 聚合酶。該步驟的時間取決于所使用的聚合酶。
2.變性步驟。DNA是雙鏈分子，DNA擴增需要引物與單鏈DNA模板相互作用。在此步驟中，將反應混合物加熱至 94-98°C 并保持 20-30 秒，以破壞兩條鏈之間的氫鍵并生成單鏈 DNA 分子。此時進入 PCR 循環(huán)。
3.退火步驟。變性后，反應混合物中的 DNA 模板是單鏈的。由于引物與DNA模板互補，當反應溫度降低到50-65℃時，引物會與模板序列匹配，互補堿基之間形成氫鍵。退火溫度取決于所用引物的Tm，一般比引物Tm低3-5℃左右。該步驟將持續(xù)約 20-40 秒以完全退火，然后聚合酶將定位到引物-模板雜交體以開始 DNA 組裝。
4.伸長步驟。在此步驟中，DNA 聚合酶開始合成 DNA，因此溫度應為 DNA 聚合酶的最適溫度。一般選擇 72°C，但有些酶在 68°C 時效果更好。這一步與體內DNA復制非常相似，DNA聚合酶將dNTPs添加到引物中，以5'到3'方向與模板互補，最終產(chǎn)生新的雙鏈DNA片段。延伸時間取決于目標 DNA 片段的長度和 DNA 聚合酶的能力。一般來說，DNA 聚合酶每 60 秒產(chǎn)生一千個堿基。
5. 2~4步稱為一個循環(huán)，每循環(huán)一次，目標片段量翻倍。一個 PCR 過程使用 30-35 個循環(huán)。在 PCR 循環(huán)的早期，PCR 產(chǎn)物以指數(shù)速率積累，而在 PCR 循環(huán)的后期，隨著 dNTPs、引物的減少和 DNA 聚合酶在變性溫度下的失活，反應減慢，PCR 速率逐漸下降。
6.最終伸長率。30-35個循環(huán)結束后，在68-74℃的溫度下最終延伸約5-10分鐘，以充分延伸剩余的單鏈DNA。
7.貯存。最終產(chǎn)品可以在 PCR 機器中維持溫度在 4-10°C。
在開始PCR實驗之前，必須準備好DNA模板（基因組DNA或逆轉錄制備的cDNA）、特異性引物（自己設計或用軟件設計），并選擇合適的商業(yè)酶（選擇符合您實驗目的的酶)
1.DNA聚合酶。有許多商業(yè) DNA 聚合酶，它們具有不同的特性。一般分為兩類：高保真聚合酶和普通Taq聚合酶。如果您想對沒有任何突變的特定 DNA 片段進行 PCR，請選擇高保真聚合酶。如果只是想檢測特定序列的存在，就選擇普通的Taq聚合酶。如果要對T-vector連接的片段進行PCR，要注意，因為大多數(shù)高保真聚合酶的產(chǎn)物都沒有A-tailing，所以應該選擇普通的Taq聚合酶或在PCR實驗后添加A-tailing。
2.引物的特異性影響 PCR 成功的概率，良好的引物設計對 PCR 擴增的成功至關重要。當您開始設計引物時，應仔細考慮以下幾個原則：
①引物的長度。PCR引物一般在18-22bp左右。這對于引物特異性和在退火溫度下的結合來說是足夠長的。
②熔化溫度(Tm)。Tm 定義為在此溫度下，DNA 雙鏈體的一半將解離成單鏈 DNA。52-58C 范圍內的引物 Tm 是最佳的。
③GC 含量。最佳 GC 含量應為 40-60%。
④許多軟件可用于引物設計，例如primer5和Oligo。這些軟件推薦的引物通�？梢詽M足我們的需求。
二、實驗步驟：
根據(jù)PCR使用說明進行試劑混合預配，并設置 PCR 循環(huán)。
簡而言之，PCR需要經(jīng)過以下循環(huán)：
1.初始化步驟。這僅對熱啟動 PCR 必不可少。此步驟將溶液加熱至 94-98°C，以激活 DNA 聚合酶。該步驟的時間取決于所使用的聚合酶。
2.變性步驟。DNA是雙鏈分子，DNA擴增需要引物與單鏈DNA模板相互作用。在此步驟中，將反應混合物加熱至 94-98°C 并保持 20-30 秒，以破壞兩條鏈之間的氫鍵并生成單鏈 DNA 分子。此時進入 PCR 循環(huán)。
3.退火步驟。變性后，反應混合物中的 DNA 模板是單鏈的。由于引物與DNA模板互補，當反應溫度降低到50-65℃時，引物會與模板序列匹配，互補堿基之間形成氫鍵。退火溫度取決于所用引物的Tm，一般比引物Tm低3-5℃左右。該步驟將持續(xù)約 20-40 秒以完全退火，然后聚合酶將定位到引物-模板雜交體以開始 DNA 組裝。
4.伸長步驟。在此步驟中，DNA 聚合酶開始合成 DNA，因此溫度應為 DNA 聚合酶的最適溫度。一般選擇 72°C，但有些酶在 68°C 時效果更好。這一步與體內DNA復制非常相似，DNA聚合酶將dNTPs添加到引物中，以5'到3'方向與模板互補，最終產(chǎn)生新的雙鏈DNA片段。延伸時間取決于目標 DNA 片段的長度和 DNA 聚合酶的能力。一般來說，DNA 聚合酶每 60 秒產(chǎn)生一千個堿基。
5. 2~4步稱為一個循環(huán)，每循環(huán)一次，目標片段量翻倍。一個 PCR 過程使用 30-35 個循環(huán)。在 PCR 循環(huán)的早期，PCR 產(chǎn)物以指數(shù)速率積累，而在 PCR 循環(huán)的后期，隨著 dNTPs、引物的減少和 DNA 聚合酶在變性溫度下的失活，反應減慢，PCR 速率逐漸下降。
6.最終伸長率。30-35個循環(huán)結束后，在68-74℃的溫度下最終延伸約5-10分鐘，以充分延伸剩余的單鏈DNA。
7.貯存。最終產(chǎn)品可以在 PCR 機器中維持溫度在 4-10°C。
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