腫瘤的發(fā)展與腫瘤微環(huán)境息息相關(guān)。在癌癥發(fā)生中，正常組織中和諧的細(xì)胞相互作用關(guān)系被破壞，逐漸演變成適應(yīng)腫瘤生長(zhǎng)的條件。腫瘤微環(huán)境的變化，可能導(dǎo)致不同細(xì)胞區(qū)室的基因、蛋白表達(dá)及信號(hào)通路的改變。針對(duì)腫瘤微環(huán)境的檢測(cè)和表征研究可為癌癥治療提供新的思路。

傳統(tǒng)分析技術(shù)受取樣精確度以及分析靈敏度的限制，無(wú)法精準(zhǔn)獲取靶向部位，而對(duì)其中特異代謝物的差異表征就更加困難。激光顯微切割技術(shù)可以方便地對(duì)特定的組織區(qū)域精確分離。結(jié)合高靈敏度的液質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)技術(shù)，從而將空間定位準(zhǔn)確的微區(qū)細(xì)胞代謝譜進(jìn)行全面準(zhǔn)確的表征。

 

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

樣品制備：

將腫瘤組織做冰凍切片，樣本置于徠卡LMD7激光顯微切割載物臺(tái)；接收端放置PCR管用于分離體的接收。選擇合適切割面積 ( ~1,000,000µm²用于代謝物建庫(kù)；~20,000µm²用于大樣本靶向分析)開(kāi)始進(jìn)行切割（圖1）。切割完成后，小心收集樣品。共收集到來(lái)自10個(gè)病人的原位癌 (25份)、浸潤(rùn)癌 (18份)、癌旁組織 (13份) 樣本共46份，每一份在平行的兩張張切片上同樣位置分別收集作為代謝組學(xué)和脂質(zhì)組學(xué)分析。

圖1. 組織切片樣本用于激光顯微切割分離體制備。經(jīng)過(guò)蘇木精-伊紅（HE）染色確定組織切片中不同類型的細(xì)胞區(qū)域（左）包括原位癌、浸潤(rùn)癌和癌旁細(xì)胞，在平行的未染色組織切片中的相應(yīng)位置進(jìn)行激光顯微切割獲得分離體（右）。

樣品提取：

裝有樣品的PCR管加入50µL提取溶液（代謝組學(xué)樣本：甲醇:乙腈:水 2:2:1, v/v；脂質(zhì)組學(xué)樣本：二氯甲烷:甲醇 1:1, v/v），振蕩混勻，超聲15 min，離心后將全部溶液轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣小瓶中待LC-MS/MS分析。

LC-MS條件：

樣品通過(guò)ExionLC^™系統(tǒng)分別串聯(lián)SCIEX ZenoTOF 7600和SCIEX Triple Quad 7500 系統(tǒng)進(jìn)行代謝物建庫(kù)和大樣本量靶向代謝組學(xué)/脂質(zhì)組學(xué)分析。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

數(shù)據(jù)通過(guò)SCIEX OS 軟件3.1中的定性、定量功能處理。在代謝組學(xué)樣本中共檢出100個(gè)代謝物，脂質(zhì)組學(xué)樣本中共檢出502個(gè)代謝物，并將這些化合物在所有的樣本進(jìn)行峰面積提取。將獲得的各種組織中化合物含量信息進(jìn)行生物統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以浸潤(rùn)癌組織v.s.癌旁組織為例，尋找表征區(qū)分這兩種組織的差異代謝物。以t-檢驗(yàn)p-value值小于0.05以及PLSDA分析VIP值不小于1作為篩選條件，對(duì)這兩種組織的區(qū)分，共找到84個(gè)差異代謝物（圖2）。

圖2. 浸潤(rùn)癌組織v.s.癌旁組織中的差異代謝物熱圖。通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，包括t-test的p值小于0.05以及PLSDA計(jì)算的VIP值不小于1作為篩選條件，獲得了84個(gè)差異代謝物。

小結(jié)

通過(guò)對(duì)組織切片進(jìn)行激光顯微切割獲取空間定位準(zhǔn)確的微量樣本，并與SCIEX ZenoTOF 7600和SCIEX Triple Quad7500系統(tǒng)相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)微量細(xì)胞水溶性和脂溶性代謝物的全面表征以及高靈敏度組學(xué)分析。

可將此方案應(yīng)用于其他組織切片樣本，助力空間組學(xué)研究的開(kāi)展。

感謝SCIEX中國(guó)的支持

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