活細胞成像應用于細胞凋亡檢測
概述：
在多細胞生物體中，細胞增殖和細胞死亡之間的平衡可維持生物體的平衡。細胞死亡有兩種常見形式，即細胞凋亡和細胞壞死。細胞凋亡通常等同于細胞的程序性死亡，是細胞死亡的一種生理形式，負責清除細胞。細胞凋亡在形態(tài)學和生物化學上的特征是細胞萎縮、染色質密集凝結、細胞出芽、碎裂、被附近細胞快速吞噬以及DNA 斷裂成約 200 個堿基對的單位[1]。細胞凋亡可由內在通路或外源性途徑激活，在細胞凋亡的內在途徑和外在途徑中，信號都會導致含Cys（半胱氨酸）的Caspases 蛋白酶家族被激活，這些蛋白酶以蛋白水解級聯(lián)的方式分解和清除瀕死細胞[2]。
圖1 細胞凋亡形態(tài)過程
平均而言，成人每天有 50-800 億個細胞發(fā)生凋亡。在這個生物過程中，感染的細胞、癌前細胞和其他癌細胞被成功消除，并維持人體細胞的平衡。因此，細胞凋亡是負責細胞正常發(fā)育、細胞周期成熟和維持細胞正常功能和活動的重要過程。
細胞凋亡檢測方法：
細胞凋亡的檢測方式多種多樣，可以大致分為基于形態(tài)學的觀察以及基于功能學的測定。形態(tài)學的觀察可以使用電子顯微鏡以及細胞核的染色進行觀察；細胞功能學的測定包括檢測線粒體膜電位（TMRM染料），檢測細胞膜表面磷脂酰絲氨酸；通過標記凋亡分子也可用于對細胞凋亡的檢測，如Caspase3/7的熒光活性探針。
四甲基羅丹明甲基酯（Tetramethylrhodamine, methyl ester， TMRM）是一種滲透性細胞染料，可累積在具有完整膜電位的活性線粒體中。如果細胞線粒體正常且發(fā)揮功能，則發(fā)出熒光信號。一旦線粒體膜電位丟失，TMRM便不再累積，熒光信號變弱或消失。
活化的Caspase3/7是Caspase家族的一員，可特異性地切割某些稱為DEVD的肽，熒光團結合的DEVD可用于量化Caspase的活性與細胞凋亡。
圖2 Caspase3/7的染色作用機理
對細胞凋亡的評估通常采用間接的終點測定法，且TMRM染料與活性探針均為活細胞染料，那么是否能長期且同時記錄細胞形態(tài)與熒光的變化呢？
Celloger®系列儀器體積小巧，可以放置在多種細胞培養(yǎng)箱內，并且可以承受自生熱量，實現(xiàn)長期細胞成像。Celloger®系列優(yōu)化了熒光濾光片和光路，可以以最小的光強實時獲得清晰的活細胞明場圖像和熒光圖像，極大程度的降低細胞光毒性。Celloger®系列產品包括Celloger Nano、Celloger Mini Plus、 Celloger Pro以及Celloger Stack，可根據自己的需求選擇需要的產品（圖3）。
圖3 Celloger® 系列
應用實例：
1、Celloger® Nano記錄細胞凋亡的發(fā)生（Caspase3/7的熒光活性探針）
Staurosporine是一種已知的激活Caspase并誘導細胞凋亡的化學物。使用Celloger® Nano，在4x物鏡下每隔30分鐘采集一次圖像，共拍攝15小時30分鐘。結果表明經Staurosporine(1 μM)處理后，DEVD被切割，熒光物質被釋放并被檢測到，熒光強度隨著時間的增加而增加（圖4）。
圖4 測定Staurosporine誘導HeLa細胞發(fā)生凋亡的情況 (比例尺，200μm)
通過熒光覆蓋圖來定量隨時間變化的細胞凋亡情況。從圖中可以看出，使用Staurosporine兩個半小時后開始檢測到熒光，處理10h后反應達到飽和（圖5）。
圖5 隨時間變化的熒光覆蓋度
2、Celloger® Mini Plus記錄細胞凋亡的發(fā)生（TMRM染料標記線粒體膜電位）
CCCP是一種線粒體凋亡誘導劑。使用Celloger® Mini Plus，在4x物鏡下延時記錄5分鐘的HeLa細胞凋亡發(fā)生情況，其中HeLa細胞被TMRM染色。結果表明經CCCP(25 μM)處理后，熒光強度減弱，這表明細胞發(fā)生了凋亡（圖6）。
圖6 HeLa細胞的凋亡情況
結語：
使用Celloger®活細胞成像系統(tǒng)可以使研究人員在自然狀態(tài)下觀察細胞的變化，不用更改細胞的結構功能等，使得實驗結果更接近體內發(fā)生的真實情況，而且可以長時間觀察記錄細胞的動態(tài)過程。使用Celloger®系列活細胞成像系統(tǒng)將拓展您的細胞研究思路，為您提供獲得最佳質量圖像和準確研究結果所需工具。各種基于細胞的研究工作和應用都可以在這個全方位系統(tǒng)內完成。
參考文獻：
[1] Teraki Y, Shiohara T. Apoptosis and the skin. Eur J Dermatol. 1999 Jul-Aug;9(5):413-25; quiz 426.
[2] Peter ME. Programmed cell death: Apoptosis meets necrosis. Nature. 2011 Mar 17;471(7338):310-2.
在多細胞生物體中，細胞增殖和細胞死亡之間的平衡可維持生物體的平衡。細胞死亡有兩種常見形式，即細胞凋亡和細胞壞死。細胞凋亡通常等同于細胞的程序性死亡，是細胞死亡的一種生理形式，負責清除細胞。細胞凋亡在形態(tài)學和生物化學上的特征是細胞萎縮、染色質密集凝結、細胞出芽、碎裂、被附近細胞快速吞噬以及DNA 斷裂成約 200 個堿基對的單位[1]。細胞凋亡可由內在通路或外源性途徑激活，在細胞凋亡的內在途徑和外在途徑中，信號都會導致含Cys（半胱氨酸）的Caspases 蛋白酶家族被激活，這些蛋白酶以蛋白水解級聯(lián)的方式分解和清除瀕死細胞[2]。
圖1 細胞凋亡形態(tài)過程
平均而言，成人每天有 50-800 億個細胞發(fā)生凋亡。在這個生物過程中，感染的細胞、癌前細胞和其他癌細胞被成功消除，并維持人體細胞的平衡。因此，細胞凋亡是負責細胞正常發(fā)育、細胞周期成熟和維持細胞正常功能和活動的重要過程。
細胞凋亡檢測方法：
細胞凋亡的檢測方式多種多樣，可以大致分為基于形態(tài)學的觀察以及基于功能學的測定。形態(tài)學的觀察可以使用電子顯微鏡以及細胞核的染色進行觀察；細胞功能學的測定包括檢測線粒體膜電位（TMRM染料），檢測細胞膜表面磷脂酰絲氨酸；通過標記凋亡分子也可用于對細胞凋亡的檢測，如Caspase3/7的熒光活性探針。
四甲基羅丹明甲基酯（Tetramethylrhodamine, methyl ester， TMRM）是一種滲透性細胞染料，可累積在具有完整膜電位的活性線粒體中。如果細胞線粒體正常且發(fā)揮功能，則發(fā)出熒光信號。一旦線粒體膜電位丟失，TMRM便不再累積，熒光信號變弱或消失。
活化的Caspase3/7是Caspase家族的一員，可特異性地切割某些稱為DEVD的肽，熒光團結合的DEVD可用于量化Caspase的活性與細胞凋亡。
圖2 Caspase3/7的染色作用機理
對細胞凋亡的評估通常采用間接的終點測定法，且TMRM染料與活性探針均為活細胞染料，那么是否能長期且同時記錄細胞形態(tài)與熒光的變化呢？
Celloger®系列儀器體積小巧，可以放置在多種細胞培養(yǎng)箱內，并且可以承受自生熱量，實現(xiàn)長期細胞成像。Celloger®系列優(yōu)化了熒光濾光片和光路，可以以最小的光強實時獲得清晰的活細胞明場圖像和熒光圖像，極大程度的降低細胞光毒性。Celloger®系列產品包括Celloger Nano、Celloger Mini Plus、 Celloger Pro以及Celloger Stack，可根據自己的需求選擇需要的產品（圖3）。
圖3 Celloger® 系列
應用實例：
1、Celloger® Nano記錄細胞凋亡的發(fā)生（Caspase3/7的熒光活性探針）
Staurosporine是一種已知的激活Caspase并誘導細胞凋亡的化學物。使用Celloger® Nano，在4x物鏡下每隔30分鐘采集一次圖像，共拍攝15小時30分鐘。結果表明經Staurosporine(1 μM)處理后，DEVD被切割，熒光物質被釋放并被檢測到，熒光強度隨著時間的增加而增加（圖4）。
圖4 測定Staurosporine誘導HeLa細胞發(fā)生凋亡的情況 (比例尺，200μm)
通過熒光覆蓋圖來定量隨時間變化的細胞凋亡情況。從圖中可以看出，使用Staurosporine兩個半小時后開始檢測到熒光，處理10h后反應達到飽和（圖5）。
圖5 隨時間變化的熒光覆蓋度
2、Celloger® Mini Plus記錄細胞凋亡的發(fā)生（TMRM染料標記線粒體膜電位）
CCCP是一種線粒體凋亡誘導劑。使用Celloger® Mini Plus，在4x物鏡下延時記錄5分鐘的HeLa細胞凋亡發(fā)生情況，其中HeLa細胞被TMRM染色。結果表明經CCCP(25 μM)處理后，熒光強度減弱，這表明細胞發(fā)生了凋亡（圖6）。
圖6 HeLa細胞的凋亡情況
結語：
使用Celloger®活細胞成像系統(tǒng)可以使研究人員在自然狀態(tài)下觀察細胞的變化，不用更改細胞的結構功能等，使得實驗結果更接近體內發(fā)生的真實情況，而且可以長時間觀察記錄細胞的動態(tài)過程。使用Celloger®系列活細胞成像系統(tǒng)將拓展您的細胞研究思路，為您提供獲得最佳質量圖像和準確研究結果所需工具。各種基于細胞的研究工作和應用都可以在這個全方位系統(tǒng)內完成。
參考文獻：
[1] Teraki Y, Shiohara T. Apoptosis and the skin. Eur J Dermatol. 1999 Jul-Aug;9(5):413-25; quiz 426.
[2] Peter ME. Programmed cell death: Apoptosis meets necrosis. Nature. 2011 Mar 17;471(7338):310-2.
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