文章標(biāo)題：Effects of Dangshen Yuanzhi Powder on learning ability and gut microflora in rats with memory disorde
發(fā)表期刊：Journal of Ethnopharmacology
影響因子：5.195
作者單位：山西中醫(yī)藥大學(xué)
百趣提供服務(wù)：糞便16S rRNA菌群測(cè)序分析

研究背景
記憶障礙(Memory disorder, MD)是一種常見的臨床癥狀，主要指由病理生理或情境原因產(chǎn)生的永久性或暫時(shí)性信息識(shí)別能力喪失。目前，開發(fā)能夠幫助改善記憶或認(rèn)知的新藥是醫(yī)學(xué)和社會(huì)的共同需要。在臨床實(shí)踐中，一些單靶點(diǎn)化療藥物難以適應(yīng)不同類型的MD，且許多治療藥物往往存在藥物依賴、戒斷反彈高、副作用嚴(yán)重等缺陷。

中醫(yī)作為一種補(bǔ)充和替代醫(yī)學(xué)，對(duì)MD具有較好的預(yù)防和治療效果，具有綜合和綜合治療優(yōu)勢(shì)。遠(yuǎn)志散是一種常用的中藥復(fù)方，具有增強(qiáng)記憶和學(xué)習(xí)的功效。早期研究表明黨參遠(yuǎn)志散(Dangshen Yuanzhi Powder, DYP)可提高M(jìn)D動(dòng)物的學(xué)習(xí)記憶能力，且其療效優(yōu)于或相當(dāng)于使用人參(Ginseng Radix Et Rhizoma, GRR)遠(yuǎn)志散。

為揭示腸道菌群在DYP治療MD中的作用，按每組12只大鼠，分為對(duì)照組(control)、MD組(Model)、吡拉西坦組(Piracetam)、DYP低劑量處理組(DYP low dose treatment group, DYP-L)和DYP高劑量處理組(DYP high dose treatment group, DYP-H)。除對(duì)照組外，其余各組大鼠均腹腔注射400mg/kg的D-半乳糖(D-Galactose, D-Gal)，并灌喂氯化鋁(200mg/kg)，連續(xù)50天。

從第15天開始，DYP組大鼠灌胃不同劑量的DYP（低劑量：6.67g/kg，高劑量：13.34g/kg），吡拉西坦組給藥吡拉西坦片混懸液0.5g/kg，模型組及對(duì)照組在實(shí)驗(yàn)期間用相同體積的生理鹽水處理。代謝組學(xué)分享，通過“菌-腸-腦”軸探討DYP的調(diào)控機(jī)制，探索DYP治療MD的相關(guān)腸道菌群調(diào)節(jié)途徑，對(duì)大鼠腸道菌群進(jìn)行16S rRNA高通量測(cè)序，以評(píng)估DYP對(duì)腸道菌群的影響。此外，利用KEGG數(shù)據(jù)庫對(duì)腸道菌群的功能進(jìn)行預(yù)測(cè)，分析DYP對(duì)MD的潛在作用機(jī)制，為進(jìn)一步闡明DYP的作用機(jī)制提供了更多的理論依據(jù)。

研究結(jié)果
01血清中DYP成分的鑒定與分析
對(duì)黨參遠(yuǎn)志散入血成分進(jìn)行了鑒定。經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)品鑒定為3,6'-二芥子酰基蔗糖、β-細(xì)辛醚、小檗堿、巴馬汀和苦參堿。

02DYP對(duì)大鼠體重的影響
在實(shí)驗(yàn)過程中，各組大鼠的體重都有不同程度的增加趨勢(shì)。代謝組學(xué)分享，DYP組大鼠體重變化趨勢(shì)相同，實(shí)驗(yàn)前期體重保持穩(wěn)定，無明顯變化，后期體重上升趨勢(shì)與對(duì)照組相同。吡拉西坦組大鼠體重在實(shí)驗(yàn)前半段呈下降趨勢(shì)，后半段與對(duì)照組一樣呈上升趨勢(shì)。
 

圖1. DYP對(duì)MD大鼠體重的影響

03大鼠趨向?qū)嶒?yàn)結(jié)果
訓(xùn)練后各組大鼠的逃避潛伏期逐漸降低（圖2A），DYP能顯著增加大鼠在平臺(tái)內(nèi)的停留時(shí)間、進(jìn)入平臺(tái)的次數(shù)和在平臺(tái)內(nèi)的運(yùn)動(dòng)距離（圖2B-D），DYP–H組的藥效學(xué)效果更為顯著，上述三個(gè)指標(biāo)的增長率分別為27%、58%和60%。圖2E顯示，D-Gal和三氯化鋁誘導(dǎo)MD后，MD大鼠在探索平臺(tái)時(shí)表現(xiàn)出明顯的邊緣搜索策略，搜索能力較差，認(rèn)知障礙明顯。
 

圖2. Morris Water Maze Test評(píng)價(jià)指標(biāo)

04DYP對(duì)血清中相關(guān)酶表達(dá)的影響
與對(duì)照組相比，MD大鼠血清中單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1, MCP-1)、神經(jīng)絲輕鏈蛋白(neurofilament light chain protein, NF-L)、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron-specific enolase, NSE)表達(dá)明顯增加，表明存在MD（圖3A-C）。代謝組學(xué)分享，圖D表明，與對(duì)照組相比，MD大鼠血清中腫瘤壞死因子-α（the tumor necrosis factor-α，TNF-α）的表達(dá)顯著降低。DYP- H組可顯著提高M(jìn)D大鼠的TNF-α水平，且療效優(yōu)于DYP- L組和吡拉西坦組，表明DYP可通過調(diào)節(jié)血清中MCP-1、NF-L、NSE、TNF-α的表達(dá)來改善記憶障礙大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。
 

圖3. DYP對(duì)MD大鼠血清中MCP-1、NF-L、NSE、TNF-α表達(dá)量的影響

05十二指腸和結(jié)腸組織的病理學(xué)分析
各組大鼠十二指腸和結(jié)腸組織的組織病理學(xué)檢查結(jié)果顯示，對(duì)照組未見明顯病理變化。代謝組學(xué)分享，與對(duì)照組相比，MD大鼠十二指腸和結(jié)腸黏膜損傷，出現(xiàn)絨毛短寬、隱窩加深、結(jié)構(gòu)不完整斷裂、脫落等病理改變。與模型組比較，各組大鼠給藥后均表現(xiàn)出不同程度的恢復(fù)，十二指腸和結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)相對(duì)完整，絨毛長度增加，隱窩變淺。不同劑量DYP對(duì)大鼠十二指腸和結(jié)腸黏膜病理損傷均有修復(fù)作用（圖4）。
 

圖4. MD大鼠腸道組織的病理學(xué)形態(tài)改變（HE，×400）。（A）十二指腸病理圖片（a-e分別為control、model、Piracetam、DYP-L組和DYP-H組）；（B）結(jié)腸上皮的病理圖片（a-e分別代表control、model、Piracetam、DYP-L組和DYP-H組）

06腸道菌群α-多樣性和β-多樣性分析
根據(jù)腸道菌群α-多樣性分析可知，各組大鼠在誘發(fā)MD后腸道菌群多樣性和豐度均升高，且吡拉西坦組持續(xù)升高。代謝組學(xué)分享，同時(shí)，發(fā)現(xiàn)DYP對(duì)MD大鼠腸道菌群豐度具有雙向調(diào)節(jié)作用。DYP-L增加了大鼠腸道菌群的豐度，而DYP-H使腸道菌群豐度降低至正常水平。β-Diversity分析反映了不同組間樣品菌群結(jié)構(gòu)的顯著差異。

07腸道菌群組成分析
如圖5A所示，在門水平上，厚壁菌門、擬桿菌門、螺旋體門和變形菌門為優(yōu)勢(shì)菌。MD大鼠腸道菌群組成與對(duì)照組差異較大，厚壁菌門增多，擬桿菌門減少。DYP-H能顯著降低厚壁菌門水平，顯著或極顯著增加擬桿菌門水平。如圖B所示，在屬水平上，乳酸菌和普雷沃氏菌為優(yōu)勢(shì)菌屬。代謝組學(xué)分享，與對(duì)照組相比，模型組乳酸菌比例顯著升高，普雷沃氏菌比例顯著降低。

吡拉西坦和DYP-L組中，乳酸菌比例顯著降低，普雷沃氏菌比例保持不變。DYP-H對(duì)降低乳酸菌和增加普雷沃氏菌有較好的調(diào)節(jié)作用。結(jié)果表明，DYP可通過調(diào)節(jié)腸道菌群組成，在一定程度上恢復(fù)MD大鼠腸道菌群失調(diào)狀態(tài)。
 

圖5. 相對(duì)豐度最高的10個(gè)細(xì)菌群落。(A)門水平；(B)屬水平

08微生物種類的線性判別分析
如圖6所示，厚壁菌門是DYP-H組的標(biāo)志菌群，這顯著影響了DYP-H組與其他組的差異，表明DYP-H能改善MD大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)，增加厚壁菌門含量。
 

圖6. 標(biāo)記區(qū)系的LEfSe分析。(A)不同物種的進(jìn)化分支；(B)不同物種的LDA分布

09腸道菌群組成和血清生化指標(biāo)的相關(guān)性分析
選取前10個(gè)高豐度菌屬和4個(gè)血清生化因子MCP-1、NF-L、NSE和TNF-α進(jìn)行Pearson相關(guān)分析。代謝組學(xué)分享，如圖11所示，MCP-1與乳桿菌呈高度正相關(guān)趨勢(shì)，與蘇黎世桿菌及Prevotellaceae_Ga6A1_group呈高度負(fù)相關(guān)趨勢(shì)。NF-L的表達(dá)與普雷沃氏菌呈高度負(fù)相關(guān)趨勢(shì)，而TNF-α的表達(dá)與普雷沃氏菌呈高度正相關(guān)趨勢(shì)。

由此表明乳酸菌、蘇黎世桿菌、普雷沃氏菌和Prevotellaceae_Ga6A1_group與MD的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。DYP可能通過調(diào)節(jié)這些細(xì)菌屬發(fā)揮改善記憶的作用，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。
 

圖7. 大鼠血清生化因子表達(dá)與腸道菌群屬水平的相關(guān)性分析

10腸道菌群功能分析
根據(jù)16s rRNA測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行KEGG功能注釋，得到KEGG各功能水平OTUs的注釋信息以及不同樣本中各功能的豐度信息（圖8）。為了進(jìn)行綜合比較，在Level 2選擇了基因相對(duì)豐度較高的前5個(gè)功能，在Level 3統(tǒng)計(jì)了它們的功能注釋信息，篩選出了幾個(gè)相對(duì)豐度較高的功能。代謝組學(xué)分享，結(jié)果表明，在Level 3（圖9），腸道菌群主要影響氨基�；�-tRNA生物合成、核糖體、糖酵解/糖異生、線粒體生物生成和丙酮酸代謝的功能。
 

圖8. Level 2腸道菌群KEGG分析
 

圖9. Level 3腸道菌群KEGG分析

結(jié)論
采用Morris水迷宮和16S rRNA菌群測(cè)序等技術(shù)對(duì)MD動(dòng)物模型進(jìn)行研究，探討DYP的調(diào)節(jié)機(jī)制。D-Gal和三氯化鋁誘導(dǎo)后，MD大鼠的學(xué)習(xí)和空間記憶能力明顯下降，并伴有體重增加和腸道菌群紊亂。

DYP可通過恢復(fù)腸道菌群紊亂和恢復(fù)與認(rèn)知密切相關(guān)的異常血清生化指標(biāo)，改善MD大鼠的學(xué)習(xí)和空間記憶能力。這提示DYP的存在可通過“菌-腸-腦”軸提高M(jìn)D大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。但DYP的具體調(diào)控機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。