文章標(biāo)題：Multi-omics profifiling visualizes dynamics of cardiac development and functions
發(fā)表期刊：Cell Reports
影響因子：9.995
作者單位：南京醫(yī)科大學(xué)
百趣提供服務(wù)：發(fā)現(xiàn)代謝組學(xué)HD-MIX版

研究背景
哺乳動物的心臟發(fā)育是一個多階段且受到嚴(yán)格調(diào)控的復(fù)雜過程，受到多種信號分子和通路在不同時間和空間上的共同精確控制，倘若此過程中的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)受到影響將會導(dǎo)致先天性心臟病的發(fā)生。因此，系統(tǒng)闡述心臟發(fā)育和成熟中的關(guān)鍵分子并解析相關(guān)疾病發(fā)生分子機制尤為重要。然而，目前心臟發(fā)育的組學(xué)研究大多基于基因的轉(zhuǎn)錄表達水平，且未有研究通過全生命周期的多組學(xué)研究來探討心臟發(fā)育和成熟的關(guān)鍵因子，阻礙了我們系統(tǒng)地理解心臟發(fā)育全過程和心臟出生缺陷發(fā)病的病因。

研究方法
為了繪制心臟發(fā)育全周期多組學(xué)圖譜，南京醫(yī)科大學(xué)科研團隊基于磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)、單細胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)等多種組學(xué)手段，描繪了心臟發(fā)育和成熟進程中關(guān)鍵通路和調(diào)控因子的分子圖譜和轉(zhuǎn)換模式。

研究結(jié)果
1小鼠心臟的多組學(xué)分析

圖1. 心臟發(fā)育過程中磷酸蛋白質(zhì)組、蛋白質(zhì)組和轉(zhuǎn)錄組的時間動態(tài)

基于轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組的分析發(fā)現(xiàn)，超過一半的基因在mRNA和蛋白質(zhì)水平之間顯示出相對較低的相關(guān)性（圖1A和1B）。但隨著時間的推移，相關(guān)性逐漸增加最終趨于穩(wěn)定，結(jié)果表明絕對mRNA水平可能不能預(yù)測蛋白質(zhì)豐度。

使用K-means聚類分析將小鼠心臟發(fā)育的10個時間點分為4個時期：E10.5–14.5的I期、E16.5–2W的II-III期和4W–8W的IV期（圖1E）。I期基因表達和磷酸化的相關(guān)性顯著更高（圖1F），這驗證了磷酸化在早期心臟發(fā)育中參與信號強烈。

2心臟發(fā)育和成熟的多組推斷和富集途徑

圖2. 心臟發(fā)育和成熟過程中三組學(xué)的關(guān)鍵途徑
 

3 MAPK和AKT通路平衡在調(diào)節(jié)心臟發(fā)育表型轉(zhuǎn)換中的作用

圖3. 心臟發(fā)育過程中信號動力學(xué)的表征和關(guān)鍵激酶底物的預(yù)測
 

蛋白磷酸化是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和級聯(lián)中翻譯后修飾的關(guān)鍵。研究人員假設(shè)具有相似時間動力學(xué)的磷酸化位點更可能是相同激酶的底物，將所有磷酸化位點分為三個主要磷酸肽簇（圖3A、4B）。分別闡述不同簇的特征：簇1的特征是早期顯著激活，隨后磷酸化水平降低，包括MAPK、CDK和CLK3種蛋白激酶（圖3B），并在下游途徑中顯著富集，如蛋白質(zhì)翻譯、細胞間粘附和蛋白質(zhì)降解（圖3C）。簇2在II-III階段顯示延遲激活和衰減（圖3B）。除了進一步激活細胞-細胞粘附和切換到激素信號通路之外，簇2中顯著富集通路與簇1中的通路相似（圖3C）。簇3顯示磷酸化水平的穩(wěn)定增加，表明在心臟發(fā)育后期激活（圖3B），該簇磷酸化位點的磷酸蛋白主要富集于心臟的生理和病理過程，包括心肌收縮（圖3C）。

另外，研究團隊采用了iGPS算法（帶相互作用過濾器的GPS算法，或體內(nèi)GPS），確定了MAPK、CDK和CLK在早期胚胎發(fā)育中起著關(guān)鍵作用，它們顯著富集了簇1磷酸肽，強調(diào)了其在啟動磷酸化信號傳導(dǎo)中的作用。同時還觀察到激酶和底物磷酸化之間的時間一致性（圖3D），這說明了激酶的時間特異性功能。從E10.5到E18.5小鼠心臟，p38 MAPK的總蛋白水平保持不變，而磷酸化（p-）p38 MAPK（180T）的蛋白水平顯著下降，進一步證實了MAPK的磷酸化在心臟發(fā)育的早期階段是重要的（圖3E）。然而，磷酸化AKT1（S124）和磷酸化AKT2（S129）的蛋白水平對E14.5中的MAPK產(chǎn)生互斥激活，暗示其對心臟發(fā)育的潛在相反影響（圖3D和3E）。

這些結(jié)果反映了MAPK和AKT對心臟發(fā)育的平衡作用，其中MAPK的磷酸化主要影響心肌細胞的分化，而AKT的磷酸化則主要影響心肌的增殖。

4 識別參與早期心臟發(fā)育的核心TFs

圖4. 鑒定調(diào)節(jié)心臟發(fā)育的主轉(zhuǎn)錄因子的表觀基因組方法

為了進一步探討轉(zhuǎn)錄因子(Transcription factors, TFs)對哺乳動物心臟發(fā)育的重要性，使用表觀組學(xué)ATAC-seq技術(shù)對E10.5產(chǎn)前小鼠心臟樣本進行了染色質(zhì)轉(zhuǎn)座酶可及性測序分析。通過預(yù)測轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，從而構(gòu)建TF-TF調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，使用足跡分析來說明該階段的調(diào)控詞典（圖4A）。代謝組學(xué)分享，將所有TFs分為三組：排名前200名的I級，排名201–400名的II級，其余的III級（圖4B）。在確定的前10個TFs中，多個TFs對小鼠或胚胎干細胞模型中的心臟發(fā)育至關(guān)重要。

此外，由于更高的時間特異性和對功能性突變的不耐受性也表明了潛在的重要作用，我們評估了I期（E10.5–E14.5）的mRNA表達，以及檢測到的所有TFs的基因?qū)�功能喪失（LoF）突變不耐受的概率（pLI評分），結(jié)果與上述結(jié)論一致（圖4C）。在心臟發(fā)育早期高表達且對LoF突變不耐受的TFs中觀察到I級TFs的富集（圖4D）。代謝組學(xué)分享，此外，TFRE18的實驗證明了這些TFs的表達和活性，I級組中檢測到的TFs的比例顯著高于II級和III級（圖4E和4F），表明I級TFs在早期心臟發(fā)育中的重要作用。

此外，作為最常見的先天性心臟病——法洛四聯(lián)癥(TOF)的患者中I級TFs的LoF和有害錯義突變顯著高于正常對照組（圖4G），而II級和III級TFs則沒有。通過足跡分析發(fā)現(xiàn)確定的關(guān)鍵TFs對心臟發(fā)育非常重要，可能是潛在的新型TOF致病基因候選。這些分析揭示了早期心臟發(fā)生時基因表達程序的嚴(yán)格時間調(diào)控，核心TFs對心臟的正常發(fā)育至關(guān)重要。

同時，為了闡明介導(dǎo)信號級聯(lián)的轉(zhuǎn)錄和染色質(zhì)調(diào)節(jié)因子，團隊研究了MAPK底物的共調(diào)節(jié)因子之間的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)。代謝組學(xué)分享，結(jié)果表明，基于實驗驗證的STRING數(shù)據(jù)，富含轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)途徑和I級TF的PPI被認(rèn)為在早期心臟發(fā)育中起關(guān)鍵作用。

5 成熟小鼠心臟TCA循環(huán)和脂質(zhì)代謝途徑

圖5. 心臟發(fā)育過程中TCA循環(huán)和脂質(zhì)的代謝途徑

基于KEGG富集分析的時間代謝組譜清楚地顯示，在心臟發(fā)育過程中，代謝產(chǎn)物的數(shù)量發(fā)生了顯著變化，主要在TCA循環(huán)和心臟的脂質(zhì)代謝途徑中富集（圖5A和5B）。圖5C質(zhì)譜中可以看出脂肪酸b氧化(FAO)和TCA循環(huán)中的代謝底物被消耗，而關(guān)鍵限速酶被高度表達。代謝組學(xué)分享，此外，單細胞轉(zhuǎn)錄譜顯示，成熟CM是參與TCA和FAO代謝的主要細胞亞群，表明這兩種代謝途徑是心肌收縮的主要能量來源（圖5D和5E）。

6 MHC-II+原住型巨噬細胞中花生四烯酸代謝促進傳出細胞增生引起的凋亡細胞吞噬

圖6. 成年小鼠心臟MHC-II+原住型巨噬細胞中花生四烯酸的特異性代謝
 

花生四烯酸(AA)在心臟中也表現(xiàn)出代謝水平的上升（圖5A、5B和6B）。AA合成基因在早期的表達很高，而AA合成基因在成年小鼠心臟中高度表達則表明在后期階段AA基因具有很高的生物活性（圖6A–6C）。

單細胞測序結(jié)果表明前列腺素內(nèi)過氧化物合成酶1（Ptgs1）是將AA轉(zhuǎn)化為前列腺素E2（PGE2）的限速步驟，在成年小鼠心臟的巨噬細胞中特異性表達（圖6D）。代謝組學(xué)分享，根據(jù)CCR2的表達和依賴性將巨噬細胞分為三個不同的簇，Ptgs1主要在某些MHC-II+原住型巨噬細胞中表達（圖6E和6F）。橫主動脈收縮(TAC)術(shù)后MHC-II+原住型巨噬細胞的Ptgs1+細胞比例顯著增加（圖6G）。這表明Ptgs1通過促進MHC-II+原住型巨噬細胞的成熟而發(fā)揮心臟保護作用。有趣的是，在進一步對Ptgs1高表達細胞中的上調(diào)基因進行通路分析中發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵傳出細胞受體/酶、CX3C趨化因子受體1（Cx3cr1）和生長抑制特異性6（Gas6）的表達顯著高于MHC-II+/Ptgs1–原住型巨噬細胞（圖6I）。代謝組學(xué)分享，上述數(shù)據(jù)表明，AA及其代謝產(chǎn)物可能通過凋亡細胞的傳出細胞增生在組織修復(fù)中發(fā)揮潛在作用。

研究結(jié)論
該團隊結(jié)合磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)和機器學(xué)習(xí)方法構(gòu)建磷酸激酶與底物的互作網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)MAPKs和AKTs激酶的平衡激活是心肌細胞分化和增殖能力梯度轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵開關(guān)；還利用表觀組學(xué)ATAC-seq和功能組學(xué)TFRE技術(shù)系統(tǒng)鑒定了心臟發(fā)育早期的核心轉(zhuǎn)錄因子，類器官及遺傳分析均發(fā)現(xiàn)上述核心轉(zhuǎn)錄因子及其遺傳突變在先天性心臟病的發(fā)生中發(fā)揮重要作用；最后，作者結(jié)合代謝組學(xué)和單細胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)花生四烯酸代謝參與心臟MHC-II+原住型巨噬細胞對凋亡心肌細胞的胞葬作用。

該研究為心臟發(fā)育和成熟提供了全面的分子描述，顯著豐富了現(xiàn)有的數(shù)據(jù)集，它們一起揭示了支撐心臟發(fā)育和成熟的復(fù)雜但協(xié)調(diào)的分子機制。代謝組學(xué)分享，該方法提供了一個通用框架的示例，該框架能夠?qū)Σ煌�器官或組織發(fā)育的多層次控制進行新的理解，并為驗證致病性突變、告知疾病機制提供功能注釋。