文章標題：Qing-Chang-Hua-Shi granule ameliorates DSS-induced colitis by activating NLRP6 signaling and regulating Th17/Treg balance
發(fā)表期刊：Phytomedicine
影響因子：6.656
作者單位：江蘇省中醫(yī)院
百趣提供服務：中藥非靶標代謝組學

研究背景
作為一種炎癥性腸病(inflammatory bowel disease, IBD)，潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis, UC)常見于30-40歲的成年人，以腹痛、血性腹瀉和里急后重為特征。代謝組學分享，5-氨基水楊酸(5-Aminosalicylic acid, 5-ASA)類、糖皮質激素類、生物制劑和免疫調節(jié)劑是UC的主要藥物。盡管具有一定的治療效果，但由于其副作用和高成本，這些藥物的使用受到限制。因此，開發(fā)具有低不良反應率的替代治療劑治療UC勢在必行。

輔助性T細胞17(T helper 17, Th17)的分泌物能介導炎癥反應，在IBD患者的結腸粘膜中Th17細胞數增加。代謝組學分享，調節(jié)性T細胞(Regulatory T, Treg)具有維持免疫穩(wěn)態(tài)的能力。IBD患者和患UC小鼠的Treg數均降低，UC的發(fā)生和發(fā)展受到Th17和Treg細胞之間不平衡的顯著影響。

NOD樣受體家族熱蛋白結構域6(NOD-like receptor family pyrin domain containing 6, NLRP6)在腸道和肝臟中具有高水平的表達，并在調節(jié)炎癥，維持上皮完整性和調節(jié)免疫穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮作用。NLRP6在腸道細胞內募集ACS（Adaptor Apoptosis-associated Speck，一類蛋白，在癥狀嚴重的炎癥部位中性粒細胞中ASC表達增多）形成炎癥小體，最終與Caspase-1聚合共同參與促使IL-1β和IL-18（二者都屬于白介素）成熟。代謝組學分享，IL-1β和IL-18對于炎癥的調節(jié)起著重要的作用，與正常小鼠相比，NLRP6缺失的小鼠DSS誘導后表現出更嚴重的結腸炎癥，同時IL-18水平降低。IL-18還能夠維持結腸中的腸屏障完整性。IL-1β通過激活IL-1受體(IL-1R)信號傳導促進Th17細胞分化和膨大。因此，預計NLRP6信號傳導可能成為UC治療的新靶點。

中藥清腸化濕顆粒（以下簡稱為：QCHS）在中國廣泛用于治療潰瘍性結腸炎。本文作者先前的研究證實QCHS顆粒和QCHS的多種中藥成分在實驗性結腸炎模型中的藥理活性。代謝組學分享，然而，QCHS的作用機制和作用靶點有待進一步探索。本次研究就旨在評估QCHS對結腸炎的治療效果并揭示其作用機制。

實驗方法
在進行所有實驗之前，使用UHPLC-QTOF-MS法對QCHS提取物中的有效成分進行了定性分析（由百趣生物提供）。后續(xù)實驗流程如下：
 

實驗結果
1.QCHS顆粒草藥成分的UHPLC-QTOF-MS分析結果
正、負模式下QCHS提取液的總離子色譜圖(TIC)如圖1所示，鑒定了每種草藥的代表性化合物質譜峰位置被標記在圖上并列于表2。

圖1. 通過UHPLC-QTOF-MS分析QCHS的正(A)負(B)模式下總離子色譜圖(TIC)

表2. QCHS中生物活性化合物的化學特性

2.QCHS能減輕小鼠DSS誘導的結腸炎
作者通過建立DSS誘導的UC模型以評估QCHS的作用（圖2A）。DSS處理7天后，與對照組相比，模型組體重減輕，疾病活動指數(DAI)增加，結腸長度縮短，而QCHS和5-ASA治療顯著減輕了DSS誘導的UC癥狀（圖2B–E）。代謝組學分享，H＆E染色評估UC小鼠的病理損傷結果：DSS組結腸有隱窩丟失，炎性細胞浸潤和明顯的粘膜損傷。然而，QCHS和5-ASA明顯緩解了結腸組織的病理狀態(tài)（圖2F）。總的來說，結果表明QCHS治療改善了DSS誘導的UC小鼠的病理體征，高劑量QCHS的治療效果優(yōu)于5-ASA（圖2B-F）。
 

圖2. QCHS治療減輕了DSS誘導的小鼠結腸炎

3.QCHS治療能抑制UC小鼠的結腸炎癥反應
作者檢測了血清中經典促炎細胞因子的水平。DSS給藥可顯著提高IL-6，IL-1β和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的水平，而QCHS治療后可顯著降低三者的水平（圖3A-C）。代謝組學分享，絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)和核因子-κB(NF-κB)的信號轉導與炎癥反應密切相關，數據表明QCHS治療降低了MAPK（JNK，ERK和p38）(D)和NF-κB途徑的核心分子：IKKα/β，IκBα和p65的磷酸化水平(E)。上述結果表明QCHS顯著抑制了DSS誘導的炎癥反應。

圖3. QCHS抑制UC小鼠結腸組織的炎癥反應

4 QCHS促進UC小鼠的粘膜完整性
如圖所示，DSS誘導后杯狀細胞的數量和粘蛋白產生的減少，但在QCHS處理后顯著增加（圖4A）。代謝組學分享，Claudin-5和粘蛋白2(Muc2)是維持腸屏障完整性的關鍵成分，從mRNA和蛋白質水平(B-D)來看，QCHS處理后兩者都得到了改善。該數據表明，使用QCHS治療可以增強UC小鼠的粘膜完整性。
 

圖4. QCHS改善UC小鼠腸粘膜的完整性

5.QCHS維持UC小鼠Th17/Treg的平衡
如圖5A所示，QCHS處理后UC小鼠MLN中Th17的水平降低，同時Tregs的比例顯著增加（圖5B）。代謝組學分享，QCHS使Th17-特異性轉錄因子和細胞因子（RORγt，IL-17和IL-22）下調（圖5C），而Treg的mRNA水平表征轉錄因子叉頭框蛋白P3（Foxp3），細胞因子IL-10和TGF-β上調（圖5D）。Western blot分析結果表明在蛋白質水平也有相同的趨勢（圖5E）。因此，QCHS重新調整了Th17和Tregs的平衡，以維持UC小鼠腸道免疫的穩(wěn)態(tài)。
 

圖5. QCHS糾正了UC小鼠的Th17/Treg失衡

6.NLRP6信號傳導參與QCHS對UC小鼠的治療作用
許多研究報道NLRP6在調節(jié)結腸炎和Th17分化中具有重要功能。檢測NLRP6炎性體信號通路的激活情況，結果顯示NLRP6在正常小鼠中高表達，但在DSS給藥后顯著降低，隨后通過QCHS處理，這種趨勢發(fā)生逆轉（圖6A）。代謝組學分享，DSS給藥后，小鼠結腸組織中核心炎性體成分NLRP6，ASC和IL-18的mRNA水平降低，但QCHS治療后顯著升高（圖6B-D）；DSS處理后Caspase-1的表達增加，又經QCHS處理后其表達明顯降低（圖6E）。Western blot結果表明，QCHS激活NLRP6和ASC的表達，同時調節(jié)IL-1β和IL-18的成熟（圖6F），結果表明QCHS可能對體內NLRP6信號傳導具有調節(jié)作用。
 

圖6. QCHS促進體內NLRP6炎性體信號傳導途徑的激活
 

7.QCHS在體外抑制LPS誘導的炎癥并激活NLRP6信號傳導
作者通過用LPS（1μg/ml）建立細胞炎癥模型，評估含QCHS血清的作用。結果使用含QCHS的血清處理后顯著降低了IL-6、IL-1β和TNF-α的相對水平（圖7B-D）。代謝組學分享，同樣，NLRP6炎癥小體信號通路的主要分子NLRP6、IL-18和ASC在LPS刺激下降低，但在含QCHS的血清處理后顯著升高（圖7E-G）。Western blot分析條帶的結果與體內實驗也相似（圖7I）。這些結果顯示，含QCHS的血清影響了體外炎癥反應，其機制可能與NLRP6通路有關。
 

圖7. 含有QCHS的血清抑制LPS誘導的細胞炎癥并激活NCM-460細胞中的NLRP6信號傳導途徑

為了揭示NLRP6是否是QCHS介導的炎癥反應調節(jié)的功能靶標，使用轉染NLRP6小干擾RNA（siNLRP6）以干擾正常人腸上皮細胞系NCM-460中NLRP6的表達。結果表明，阻斷NLRP6信號傳導可能導致QCHS的炎癥調節(jié)作用的消除（圖8）。因此，可以認為QCHS的治療效果與NLRP6的激活有關。
 

圖8. NLRP6干擾消除了QCHS介導的細胞炎癥調節(jié)
 

討論與總結
在正常狀態(tài)下，Th17細胞分泌特定的炎性細胞因子以維持宿主免疫，而Tregs抑制Th17的過度激活以保持平衡的免疫功能。Th17異常升高或Treg功能缺陷可能導致UC的發(fā)展。代謝組學分享，因此，靶向調節(jié)Th17/Treg是治療UC的有效方法，植物藥物是潛在的治療劑。IL-18和IL-1β的成熟直接依賴于NLRP6的激活。因此，NLRP6信號有望成為UC的新靶點。

然而，目前的藥物仍然主要用于維持或誘導緩解，由于這些藥物的缺陷，UC患者仍然面臨“治療上限”。代謝組學分享，有積極跡象表明，中藥在治療UC方面具有潛在的治療能力。在中國的一項隨機臨床試驗中，QCHS已被臨床證明對活動期UC有效且安全。

本次研究中報道了QCHS的治療效果，并揭示了QCHS在UC小鼠中的可能機制。QCHS治療減輕了UC的癥狀，表現為體重和結腸長度的恢復，DAI指數降低，粘膜損傷減輕。此外，與5-ASA相比，高劑量QCHS顯示出優(yōu)異的治療效果。QCHS治療還抑制了過度的炎癥反應，在UC小鼠中保持結腸的粘膜完整性有助于UC小鼠結腸粘膜的深度愈合。最重要的是，本研究探索了QCHS的免疫調節(jié)功能。QCHS重新平衡了Th17/Treg的水平，從而保護小鼠免受結腸炎。從機制上講，NLRP6炎性體信號通路參與QCHS介導的UC保護（圖9）。代謝組學分享，QCHS顯著激活NLRP6的表達并調節(jié)IL-1β和IL-18的成熟，因此發(fā)揮抗炎作用。進一步的體外實驗表明，QCHS的功能依賴于NLRP6的激活。
 

圖9. QCHS免疫調節(jié)和結腸保護作用的圖形摘要

綜上所述，QCHS對UC的臨床治療效果是肯定的，但其作用機制仍不清楚。代謝組學分享，本次研究結果探索了QCHS的可能靶點，為QCHS的抗炎和免疫保護作用提供了證據，并可能為其作為UC替代治療策略的發(fā)展提供機制基礎。