代謝組學(xué)文章標(biāo)題：Blockage of glycolysis by targeting PFKFB3 suppresses the development of infantile hemangioma
發(fā)表期刊：Journal of Translational Medicine
影響因子：8.44
作者單位：四川大學(xué)華西醫(yī)院
百趣提供服務(wù)：中心碳代謝

研究背景
嬰兒血管瘤(Infantile Hemangioma, IH)是嬰兒最常見的腫瘤，但其確切的發(fā)病機(jī)制尚不清楚。前期研究發(fā)現(xiàn)，糖代謝可能在IH發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用，抑制糖酵解關(guān)鍵酶磷酸果糖激酶-1可抑制IH血管生成。代謝組學(xué)分享，磷酸果糖-2-激酶/果糖-2,6-雙磷酸酶3 (PFKFB3)是一種將果糖- 6-二磷酸轉(zhuǎn)化為果糖-2,6-二磷酸的代謝酶，是限速酶磷酸果糖激酶-1最有效的變構(gòu)激活劑。本研究旨在探討PFKFB3在IH中的作用。

結(jié)果與分析
1.PFKFB3在增殖期IH組織與HemEC中高表達(dá)
共鑒定出222個(gè)差異表達(dá)基因(Differentially Expressed Genes, DEGs)（141個(gè)上調(diào)，81個(gè)下調(diào)），如下圖所示（圖1A），PFKFB3是最顯著的DEGs之一。DEGs在生物過(guò)程中主要富集在 “細(xì)胞脂代謝”等過(guò)程中（圖1B）；在KEGG途徑中主要富集在“甘油脂代謝”等通路上（圖1C）。代謝組學(xué)分享，在對(duì)芯片結(jié)果驗(yàn)證過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)PFKFB3蛋白在增殖型IH組織中的表達(dá)高于漸開化型消退期IH組織（圖1D）。此外，PFKFB3蛋白在血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞(Hemangloma-derived endothelial cell, HemEC)中的表達(dá)高于人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)（圖1E）。

總之，細(xì)胞代謝與IH的發(fā)展密切相關(guān)，PFKFB3在增殖的IH組織和HemECs中高表達(dá)，可能在IH發(fā)展的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。

圖1. PFKFB3在增殖IH組織和HemEC中的過(guò)表達(dá)

2.PFK15抑制HemEC血管生成
隨著藥物濃度的增加，PFK15（PFKFB3抑制劑）處理引起HemECs的形態(tài)學(xué)逐漸改變，包括細(xì)胞密度下降、細(xì)胞收縮和細(xì)胞碎片增加（圖2A），PFK15以劑量依賴的方式降低HemECs的活力（圖B）。代謝組學(xué)分享，為了進(jìn)一步驗(yàn)證PFK15在抑制細(xì)胞增殖中的作用，在體外評(píng)估了PFK15對(duì)HemEC體外成管的影響。結(jié)果表明，PFK15顯著抑制血管生成（圖C）�？傊�，用 PFK15抑制PFKFB3可以降低HemEC血管生成。
 

圖2. PFK15抑制HemEC血管生成

3.PFK15抑制HemEC葡萄糖代謝
對(duì)葡萄糖進(jìn)行靶向代謝組學(xué)分析。PCA（圖3A）圖顯示對(duì)照組和PFK15處理組之間存在顯著差。如火山圖（圖3B）和熱圖所示（圖3C），共鑒定出45種差異代謝物。PFKFB3被抑制后，許多糖酵解代謝物，包括葡萄糖6-磷酸、果糖6-磷酸和果糖1,6-二磷酸含量仍比對(duì)照組更高（圖3C）。與對(duì)照組相比，PFKFB3被抑制后，屬于“TCA循環(huán)”的代謝物檸檬酸、異檸檬酸、富馬酸、α酮戊二酸、蘋果酸和琥珀酸也顯著增加（圖C）。代謝組學(xué)分享，隨后選取差異最高的14種代謝物進(jìn)行KEGG通路分析。發(fā)現(xiàn)這些代謝物主要富集在糖酵解相關(guān)途徑，如“磷酸戊糖途徑”、“糖酵解/糖異生”、“丙酮酸代謝”和“TCA循環(huán)”（圖3D，E）。綜上所述，被PFK15抑制的PFKFB3可以減少HemECs的糖代謝。
 

圖3. PFK15抑制HemEC葡萄糖代謝

4.PFK15抑制HemEC遷移，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡
細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示PFK15抑制HemECs的遷移（圖4A）。此外，當(dāng)PFK15聯(lián)合普萘洛爾(propranolol)治療時(shí)，觀察到一種協(xié)同抑制作用（圖4A）。代謝組學(xué)分享，為了確定PFK15誘導(dǎo)的協(xié)同遷移抑制是否是由于細(xì)胞凋亡，使用Annexin V和PI標(biāo)記進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析。結(jié)果顯示，PFK15處理組的凋亡細(xì)胞數(shù)量大于對(duì)照組（圖4B）。

同樣，PFK15和普萘洛爾聯(lián)合治療導(dǎo)致HemECs凋亡百分比顯著增加（圖4B）。此外，通過(guò)western blot分析，PFK15和HemECs聯(lián)合治療后Bax蛋白表達(dá)上調(diào)，Bcl-2蛋白表達(dá)下調(diào)（圖4C）。代謝組學(xué)分享，與對(duì)照組相比，PFK15處理后觀察到明顯的線粒體應(yīng)激反應(yīng)，包括線粒體基質(zhì)密度增加，線粒體嵴塌陷，線粒體腫脹和線粒體空泡變性（圖4D）。線粒體應(yīng)激反應(yīng)可大大增加活性氧的產(chǎn)生，導(dǎo)致線粒體凋亡通路的激活。結(jié)果顯示，與對(duì)照組和普萘洛爾組相比，PFK15治療后ROS生成增加（圖4E，F(xiàn)）。
 

圖4. PFK15抑制HemEC遷移并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡

5.shPFKFB3抑制HemEC血管生成
為了進(jìn)一步研究PFKFB3水平是否影響血管生成活性，我們構(gòu)建了靶向PFKFB3的慢病毒載體shRNA（圖5A）。代謝組學(xué)分享，轉(zhuǎn)染shPFKFB3后，PFKFB3在HemECs中的蛋白表達(dá)水平顯著降低（圖5B）。

敲低PFKFB3也顯著抑制了HemEC的血管生成（圖5C）。shPFKFB3顯著抑制了細(xì)胞遷移（圖5D）。此外，shPFKFB3慢病毒組的凋亡細(xì)胞比例高于對(duì)照組（圖5E）。綜上所述，敲除PFKFB3顯著抑制了HemEC血管生成。
 

圖5. PFKFB3下調(diào)抑制HemEC血管生成并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡

6.PFKFB3抑制降低了HemECs中PI3K/Akt信號(hào)通路的激活
為了確定PFKFB3被抑制后IH中調(diào)控血管生成活性的關(guān)鍵通路，對(duì)PFK15處理組和對(duì)照組進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄分析。共鑒定出1240個(gè)DEGs（357個(gè)上調(diào)，783個(gè)下調(diào)）。GO分析顯示，這些DEGs主要富集在“血管生成”、“細(xì)胞粘附”和“凋亡過(guò)程的正向調(diào)控”等生物過(guò)程中（圖6A）。KEGG通路分析中顯著富集在PI3K-Akt信號(hào)通路（圖6B）。這些數(shù)據(jù)表明，PI3K-Akt通路可能參與PFK15治療后IH血管生成和細(xì)胞代謝的調(diào)節(jié)。代謝組學(xué)分享，此外，對(duì)轉(zhuǎn)錄和代謝結(jié)果進(jìn)行綜合分析的結(jié)果顯示，“糖酵解或糖異生”是最重要的途徑（圖6C），表明抑制PFKFB3主要影響HemECs中的糖酵解。

為了進(jìn)一步證明PI3K-Akt通路在PFKFB3調(diào)控中的作用，我們首先使用STRING進(jìn)行了功能蛋白關(guān)聯(lián)分析，以建立Akt和PFKFB3之間的潛在關(guān)系�？梢钥闯觯琍FKFB與Akt直接相連，Akt也與Bax和Bcl-2密切相關(guān)(圖6D)。接下來(lái)，利用Co-IP驗(yàn)證PFKFB3與Akt之間的蛋白-蛋白相互作用（圖6E）。

由于PI3K/Akt信號(hào)通路參與了PFKFB3的調(diào)控，我們?cè)噲D確定PFK15是否通過(guò)該通路誘導(dǎo)HemEC凋亡。Western Blot結(jié)果顯示，PFK15降低了PI3K和Akt的磷酸化水平（圖6F）。代謝組學(xué)分享，與單獨(dú)使用每種藥物相比，PFK15和普萘洛爾聯(lián)合使用可進(jìn)一步降低PI3K/Akt的磷酸化水平（圖6G）。此外，用shPFKFB3敲除PFKFB3可顯著降低PI3K和Akt的磷酸化水平。因此，通過(guò)抑制PFKFB3可抑制PI3K-Akt信號(hào)通路，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
 

圖6. PFKFB3抑制抑制HemECs中PI3K/Akt信號(hào)通路的激活

7.抑制PFKFB3可抑制體內(nèi)IH血管的形成
為了研究我們的體外研究結(jié)果是否可以轉(zhuǎn)化為體內(nèi)環(huán)境，我們使用HemECs和血管瘤源性周細(xì)胞建立了小鼠異種移植模型（圖7A）。14d處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，解剖實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的腫瘤（圖7B）。代謝組學(xué)分享，14d后僅PFK15組和聯(lián)合用藥組的腫瘤生長(zhǎng)顯著降低（圖7C）。

HE染色結(jié)果顯示，PFK15單獨(dú)或聯(lián)合普萘洛爾可顯著減少微血管數(shù)量（圖7C）。此外，與對(duì)照組相比，PFK15單獨(dú)使用或聯(lián)合普萘洛爾可降低CD31基因的表達(dá)（圖7C）。轉(zhuǎn)導(dǎo)shPFKFB3可減少微血管數(shù)量和CD31的表達(dá)（圖7D），沉默PFKFB3也顯著降低了MVD（圖7F）。所有這些結(jié)果都表明，抑制PFKFB3可以抑制體內(nèi)IH血管的形成。
 

圖7. 抑制PFKFB3可抑制體內(nèi)IH血管的形成

結(jié)論
總之，這些結(jié)果表明抑制PFKFB3可以降低IH血管生成并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，靶向PFKFB3可能是IH的一種新的治療策略。