湖南農業(yè)大學科研團隊揭示水稻“生長—防御”平衡調控機制！
文章標題：Rice cellulose synthase-like protein OsCSLD4 coordinates the trade-off between plant growth and defense
發(fā)表期刊：Frontiers in Plant Science
影響因子：6.627
作者單位：湖南農業(yè)大學
百趣生物提供服務：植物阿趣廣靶®代謝組學

1.代謝組學分享-研究背景
通常植物防御能力的提升伴隨著生長和繁殖成本的降低，這是一種在不利條件下微妙的適應性機制，被稱為生長-防御權衡機制。纖維素合成酶類蛋白（cellulose synthase-like D4, OsCSLD4）通過調節(jié)細胞壁多糖的合成，在水稻的植物結構中發(fā)揮重要作用。代謝組學分享，近期研究表明，OsCSLD4通過介導脫落酸的生物合成參與水稻的鹽脅迫反應。然而，OsCSLD4在水稻對生物脅迫反應中的作用機制尚未可知。在本研究中，利用合江19號水稻突變體中的葉片（dwarf and narrowed leaf in Hejiang 19 mutant, dnl19）來確定OsCSLD4在水稻生長和防御之間發(fā)生的作用，揭示了OsCSLD4在調控水稻生長和防御之間的平衡中的分子機理。

2.代謝組學分享-主要實驗

3.代謝組學分享-研究結果 水稻dnl19突變體的多態(tài)性表型
本研究檢測了dnl19突變體的旗葉長度和寬度、圓錐花序長度和節(jié)間伸長率。結果表明，在整個發(fā)育期，dnl19突變型水稻比野生型（wild type,WT）矮（圖1）。代謝組學分享，另外，與WT相比，dnl19突變體植株的葉寬、穗長、結實率以及粒徑受到影響，粒寬和千粒重顯著下降�？傊�，dnl19突變體植株表型整體上有很大變化。
 

圖1. dnl19突變體的表征 dnl19中葉脈圖案和節(jié)間細胞大小的改變

通過對葉片等部位進行組織切片觀察，發(fā)現突變株小葉脈減少進而引起窄葉表型變化，而透明細胞的顯著減小引起中葉脈厚度的減小。代謝組學分享，并且，dnl19突變株在葉脈區(qū)具有明顯比野生型更小的泡狀細胞，這表明dnl19葉片容易卷曲。對第二節(jié)間縱切面的檢測結果表明，細胞數量減少導致第二節(jié)間長度縮短。
 

圖2. dnl19突變體對葉片和莖稈結構的影響

dnl19突變體T-DNA插入的基因組側翼序列的分離
通過高效熱不對稱交錯PCR技術對dnl19突變體的T-DNA插入位點進行鑒定。代謝組學分享，結果顯示，T-DNA插到了CHR702的內含子區(qū)域。研究證明，T-DNA插入突變體以及CHR702敲除未引起任何形態(tài)上的差異變化。此外，部分未經轉基因的dnl19也具有矮小的形態(tài)。因此，推測CHR702不是dnl19突變體的致病基因。

通過MutMap分析鑒定dnl19突變體的候選區(qū)域和致病SNPs
通過分別對合江19號、dnl19突變株、正常組和矮化組樣品進行測序深度為30×的全基因組重排分析。代謝組學分享，結果表明，在候選區(qū)域的單核苷酸多態(tài)性（SNP）中，大多數 SNP指數差異（△SNP指數）大于0.6的基因位于非編碼區(qū)。位于22,606,187號核苷酸位置的SNP位于基因OsCSLD4的第一外顯子中。先前的研究表明該基因具有調節(jié)細胞壁多糖合成的功能。在密碼子302處有一個C堿基缺失引起移碼，并且過早引入了一個終止密碼子。測序分析證實突變位點和C堿基缺失可能是dnl19突變體表型異常的原因。

為了挽救dnl19突變體的各種發(fā)育缺陷，作者在玉米泛素啟動子的控制下在dnl19 植物中表達了OsCSLD4。代謝組學分享，將該基因成功引入突變體dnl19后，dnl19的表型被完全抑制。至于植株高度和葉片的形態(tài)特征，各植株間沒有差異。

表1. 染色體基因組中△SNP指數>0.6的SNP的候選基因

圖3. dnl19突變體的致病基因（OsCSLD4） 通過RNA測序對dnl19突變體進行轉錄組分析

在植物中，生長發(fā)育受損通常伴隨著防御能力增強。為明確OsCSLD4是否參與水稻防御反應，本文作者利用RNA-seq技術對抽穗期dnl19和WT旗葉進行轉錄組檢測，并結合qPCR技術檢測dnl19和WT在幼苗期和分蘗期的一些防御反應基因的表達水平。代謝組學分享，dnl19的PR基因（致病相關基因）在14日齡時顯著上調。PR基因中的其他基因在幼苗期和分蘗期都有不同程度地增加。這些結果都表明dnl19中 OsCSLD4 的破壞激活了防御反應基因的表達。
 

圖4. dnl19突變體和野生型的轉錄組分析

dnl19突變體對稻瘟病和水稻黃單胞菌的抗性發(fā)生改變
作者在苗期通過打孔接種對dnl19進行抗稻瘟病的能力評估。結果表明，接種稻瘟病菌110-2菌株后，dnl19葉片的病斑明顯減少。對每個病斑的相對真菌生物量進行研究，突變體葉片中生長的真菌較少。作者還評估了dnl19突變體對白葉枯病的抗性。通過檢測分蘗期接種PXO99的日本晴葉片中OsCSLD4的表達。代謝組學分享，結果顯示，處理48小時后的OsCSLD4表達顯著增加。然后通過頂切方法將PXO99接種到dnl19突變體的旗葉上。接種2周后，dnl19的病斑長度顯著短于WT。以上結果表明OsCSLD4基因功能的缺失增強了水稻的抗病性。

圖5. dnl19突變體和野生型對稻瘟病和水稻黃單胞菌的抗性表征

dnl19突變體的代謝分析
為了了解OsCSLD4突變的代謝反應，作者應用廣泛靶向代謝組學來研究dnl19突變體的變化情況（圖6）。在dnl19突變體中共鑒定出69種不同差異代謝物。代謝組學分享，其中，上調的差異代謝物有26種，包括L-纈氨酸、L-天冬酰胺、L-組氨酸、L-丙氨酸、龍膽酸和其他重要代謝產物；下調的差異代謝物有43種，包括L-天冬氨酸、蘋果酸、6-磷酸葡萄糖酸、6-磷酸葡萄糖、1-磷酸半乳糖、葡萄糖酸、D-天冬氨酸等（圖6C）。分析結果表明，dnl19中OsCSLD4的破壞導致L-纈氨酸、L-天冬酰胺、L-組氨酸、L-丙氨酸、龍膽酸的顯著增加，但L-天冬氨酸、蘋果酸、6-磷酸葡萄糖酸、6-磷酸葡萄糖、1-磷酸半乳糖、葡萄糖酸、D-天冬氨酸的顯著減少。
 

圖6. dnl19突變體的廣泛靶向代謝組學分析

4.代謝組學分享-結論
本研究利用dnl19進行基因組學和代謝組學的研究分析，探討了OsCSLD4在平衡水稻生長和防御之間的權衡中的重要性。代謝組學分享，一般來說，細胞壁多糖合成酶在水稻生長和非生物脅迫中具有關鍵作用，在病原體感染期間，特定低聚糖作為主要的植物源性損傷相關模式分子（damageassociated molecular pattern, DAMP）產生，并可以激活植物免疫反應。然而，尚不清楚細胞壁生物合成缺陷的dnl19或其他OsCSLD4缺失突變體是否也會釋放或提供寡糖信號分子的前體，以組成性地觸發(fā)植物防御反應，還需要進一步研究。