一、儀器介紹
轉棒儀本質上是一種簡單的設備，設計來轉動水平旋轉桿。該測試的商業(yè)化導致了一種更復雜的設備的逐步演變。該設備以電子方式運行，并且可以很容易地編程，以提供更為定制的數據收集方法，甚至可以提供安全、質量可靠、符合GLP的數據記錄，以滿足藥物開發(fā)中的法規(guī)遵從性。使用該設備的較新版本，旋轉桿可以在預先編程的時間段內以任意數量的不同速度運行，從而可以在同一試驗中完成分步測試。同樣地，該裝置可以被編程為在不同的時間長度內以不同的加速度加速，并且甚至可以在需要時反向運行橫桿。因此，有許多選項來修改測試方案，以適應實驗的具體要求。然而，就大多數實驗目的而言，定速和加速版本被廣泛使用，可以認為是廣泛的實驗模型領域的標準，可以滿足大多數實驗室的需求。

儀器主要包括一個旋轉桿，驅動電機和齒輪傳動系統(tǒng)。旋轉桿的長度和直徑取決于要測試的嚙齒動物種類。以小鼠為例，轉棒儀器的尺寸：旋轉桿直徑約為3cm，商業(yè)設備中的桿通常由有機玻璃或其他硬質塑料制成，旋轉桿表面沿縱軸形成一系列平行的水平凹槽，使小鼠能夠有效地抓住它。凹槽的深度是一個至關重要的細節(jié)，如果小鼠不能實現(xiàn)良好的抓握力，測試將會非常困難；另一方面，如果抓握力太好了，小鼠會被動地抓住桿跟隨其旋轉。旋轉桿通常支撐在儀器底座上方30～50cm，如果設置的高度太低，容易導致動物不進行任務，而傾向于從桿上跳下來。在儀器的底部放置一個柔軟的軟墊，給跌落下來的小鼠作為緩沖。正常情況下，這種儀器墜落并不會對動物造成任何傷害�？梢愿鶕�需要設計測試容量，商業(yè)設備通常包括多個通道（一般設置6個通道），可以并行測試相應數量的動物。有些商業(yè)設備設計為每個通道可以獨立開始實驗。通道由塑料隔板或者法蘭（圓形的部件）隔開，法蘭的直徑為20～30cm。通道的寬度約為6cm，但如果未成年小鼠傾向于在桿上轉身，可能需要調整得更小。一般商業(yè)設備的轉速范圍為0-100rpm/min（一般實驗設計速度范圍為4～40rpm），精度為0.1rpm/min。實驗時間可分段，每段可以設置不同的時間、速度、加速度，可靈活設置勻加速、勻減速實驗。

設備包括定時裝置，它在電機打開時會自動啟動，每個通道下鋪設有紅外旋轉桿，旋轉桿中斷時，代表動物跌落，計時停止，用于測量從旋轉桿上跌落的潛伏期。潛伏期數據傳輸到計算機上，并記錄動物落棒的原因（例如跌落、跳躍）。儀器也可以自動統(tǒng)計每組的均值、標準差，方便查看結果。大鼠的關鍵設備參數可設置為：旋轉桿直徑7～8cm，距離地面50cm，通道寬10cm。


二、實驗動物的選擇

轉棒疲勞儀適用于嚙齒類動物，更通常用于評估小鼠的運動能力。越來越多的研究人員正在使用轉基因（Tg）小鼠疾病模型作為探測疾病過程的生化，細胞和行為方面的工具，并篩選新的治療方法。因此，對Tg模型的背景品系的選擇對于對這些動物的疾病狀態(tài)進行準確的多因素評估至關重要。為了確定運動測試中表現(xiàn)的品系差異，以評估它們在預期運動參數發(fā)生變化的疾病中作為基因修飾小鼠的背景品系的適用性，并確定小鼠表現(xiàn)是否隨時間以品系特異性方式變化（這可能成為長期重復測試研究的混雜變量），有研究使用了六種近交小鼠品系進行測試，使用的品系包括129S2/SvHsd，BALB/cOlaHsd，C3H/HeHNsd，C57BL/6J，CBA/CaOlaHsd，DBA/2OlaHsd。結果表明，在旨在量化小鼠運動協(xié)調性的行為任務中存在相當大的品系差異，而且，品系特定的表現(xiàn)變化可以隨著重復測試而變化。DBA/2在定速旋轉任務上的表現(xiàn)明顯差于使用的其他小鼠品系的表現(xiàn)，并且有點令人驚訝的是，表現(xiàn)的損害發(fā)生在相對較低的速度（7～23rpm）下，而不是在更高的速度下。

有趣的是，CBA/Ca的表現(xiàn)隨時間變化最明顯，在第8周表現(xiàn)似乎比其他幾周更具彈性。定速旋轉任務比更常用的加速旋轉任務對小鼠的運動變化更敏感，后者未能確定品系或重復試驗的顯著主要影響。另外，與以往研究一致，C57BL/6J和CBA/Ca小鼠品系在加速旋轉任務上表現(xiàn)良好，而DBA小鼠表現(xiàn)不佳，這表明加速旋轉是評估運動協(xié)調的可靠方法。特別令人感興趣的是發(fā)現(xiàn)，隨著重復測試，表現(xiàn)存在品系特定的變化。使用的6種小鼠品系中有5種的表現(xiàn)隨著時間的推移保持穩(wěn)定。然而，DBA/2小鼠了解到從桿上掉下來會產生有益的后果（返回飼養(yǎng)籠），因此沒有動力留在設備上。這種行為適應導致了這種特定小鼠品系的較大誤差，并導致整體的顯著影響。我們建議，如果要將Tg小鼠用于行為測試，則必須非常小心地選擇維持Tg小鼠系的潛在背景品系。129S2/Sv品系和DBA/2品系作為純品系不適合進行行為測試，這是因為前者品系的冷漠性質和后者的性能可變性。

也有研究者研究了一些近交系，以確定轉棒測試的任務表現(xiàn)和運動學習是否存在遺傳變異。在改進的加速版本的轉棒模型中，小鼠每天接受三次試驗，持續(xù)三天，并記錄每天的轉棒表現(xiàn)。測試了雄性和雌性129S1/SvlmJ、A/J、BALB/cByJ、C3H/HeJ、C57BL/6J、CBA/J、DBA/2J和FVB/NJ小鼠。在運動表現(xiàn)方面觀察到了品系和性別差異。一些品系通常表現(xiàn)更好（如C57BL/6J和CBA/J），而其他品系表現(xiàn)較差（如A/J）。129S1/SvImJ與其他亞系相比為中等表現(xiàn)，其中129S6/SvEvTac表現(xiàn)最好，129P1/ReJ表現(xiàn)最差。不同品系的運動學習能力也有所不同，因為一些品系在三天內表現(xiàn)出任務表現(xiàn)提高，而其他品系則沒有，如DBA/2J、A/J在連續(xù)訓練中沒有表現(xiàn)出運動技能的學習能力。

這些研究綜合表明，背景品系的選擇是轉基因小鼠疾病模型中運動缺陷重復行為評估的關鍵考慮因素。

三、實驗程序
轉棒測試通過評估動物保持在旋轉桿上的能力，比較對照組與疾病模型/干預組嚙齒動物的運動表現(xiàn)。轉棒任務可以使用多個版本的方案，主要是轉速、加速度和測試時間等參數有所不同。

1.實驗材料：

1)適當的小鼠品系和飼養(yǎng)環(huán)境。

2)70%乙醇噴霧和吸水性紙巾用于清潔儀器。

3)轉棒疲勞儀。

2.設備運行準備：

1)設置旋轉桿的速度，在現(xiàn)代商業(yè)儀器上，這是一個可編程的參數。

2)檢測紅外光束是否靈敏度正常。

3.訓練動物：

動物應適應實驗設備，以盡量減少可能導致它們無意中從桿上掉下來的焦慮和探索行為。

1)對于運動協(xié)調能力的測試，不需要采集訓練時的數據。

2)先設置一個較慢的轉棒速度，通常為4rpm，將小鼠放置在旋轉桿上，這樣運行1min。對于正常小鼠，將桿的速度提高到10rpm，運行2min，當在這個速度下成功時，進一步增加速度到30rpm，并讓小鼠再保持3min。在這一階段完成后，根據使用的小鼠品系，應該給予小鼠15分鐘的休息或允許繼續(xù)訓練。附帶條件是，如果訓練過程中它們從桿上掉下來，應該將其放回到它們的飼養(yǎng)籠里進行15分鐘的恢復。

3)完成上述訓練后，允許小鼠繼續(xù)訓練標準的轉棒測試的試驗。將它們放置在儀器上，并允許它們按照測試程序進行試驗（見下文），直到它們達到穩(wěn)定的表現(xiàn)水平。

4)對于加速版本轉棒實驗，小鼠放置在旋轉桿上，桿加速到預設的終點，通常初始速度為4rpm，加速度為20rpm/min，直到達到最大速度40rpm。對于固定速度的方案，應該訓練小鼠在每個速度下達到最佳表現(xiàn)。

5)在訓練結束后，至少等待24小時再進行正式試驗。

4.用轉棒儀測量動物的運動協(xié)調/平衡

對于所有試驗，在試驗前30min將小鼠帶到實驗室，以確保它們完全清醒。一般來說，為了讓肌肉力量和覺醒水平恢復到正常，在每次運動測試后都放回到籠子里，讓小鼠休息。

4.1加速旋轉版本測試

1)捏住小鼠尾巴后1/3處，將小鼠放在靜止的旋轉桿上，背向桿旋轉的方向，每個通道里都放一只小鼠。

2)啟動轉棒，并同時開始自動計時。一般加速度設置為20rpm/min。

3)當小鼠從旋轉桿上掉下來時，如果可能的話，及時將它從設備里取出，然后放回籠子里。

4)在5min結束時，將所有仍然保持在桿上的小鼠移到飼養(yǎng)籠里。

5)記錄小鼠從旋轉桿上跌落下來的潛伏期（小鼠停留在旋轉桿上的時間），如果它們成功完成了整個測試周期，則記錄最大分數300秒。

6)通常，理想的方法是進行多次試驗，重復試驗兩到三次，每次至少間隔15min。

7)計算出這些試驗得分的平均值。這是一種典型的方法，但如果對每個單獨試驗的表現(xiàn)都很感興趣，也可以使用原始形式的數據。

8)采用非配對t檢驗分析兩組動物在單個試驗數據或平均試驗的單個數據集的差異。

9)如果對一系列試驗的表現(xiàn)感興趣，則需要進行多因素方差分析（ANOVA），包括一個受試者內因素（試驗次數、藥物劑量或重復測量設計中的其他測試條件）和任何受試者間因素（例如，腦區(qū)損毀、基因型或小鼠之間不同的治療）。對于縱向研究，將增加一個額外的受試者內因素（時間點或年齡）。

4.2定速旋轉版本測試

1)將旋轉桿的速度設置在所需的最低速度。

2)將小鼠放在旋轉桿上，每個通道里都放上一只小鼠。

3)啟動轉棒，并同時開始自動計時，測試時間最長1min。

4)當小鼠從旋轉桿上掉下來時，如果可能的話，及時將它從設備里取出，然后放回籠子里。

5)當所有小鼠完成1min的試驗后，移出它們，然后放回到飼養(yǎng)籠里。

6)記錄下小鼠能夠保持在旋轉桿上的潛伏期時間。

7)每個試驗之間至少間隔5min。

8)將設備重置到下一個要使用的速度。

9)重復步驟2）至8），直到對所有所需的旋轉桿速度進行完試驗為止。

10)通常需要進行多次試驗。在最小間隔15min后，以新的上升速度系列重復測試。

11)計算這些試驗得分的平均值。這是一種典型的方法，但如果每個試驗的表現(xiàn)都感興趣，請使用原始形式的數據。

12)如果只使用單個速度來確定兩組小鼠之間的差異，則應用非配對t檢驗。對于多個速度，應用至少一個受試者內部因素（桿速度）和通常至少一個受試者間因素（例如，基因型或損毀組）的方差分析。

13)藥物或其他治療將在分析中提供第三個處理因素，受試者內因素或受試者間因素取決于采用的是重復測量還是隨機設計。對于縱向研究，還需要第二個受試者內變量（時間點）。

四、數據收集和評價指標
大多數方案要么測試動物在給定的時間內停留的最大速度，要么測試動物在不同速度下跌落所需的時間。商業(yè)轉棒儀可以自動記錄動物的跌落潛伏期（動物保持在桿上的時間）和跌落時的旋轉速度，這是動物運動協(xié)調性的主要指標，尤其是前者。同時還能記錄試驗結束的原因，跌落、跳躍或被動旋轉。一些研究也應用了額外的或替代的指標，例如運動的距離，在規(guī)定的持續(xù)時間內在旋轉桿上保持平衡的動物數量，或在實驗運行期間從旋轉桿上跌落和動物抓住桿被動旋轉的次數。另外，可以以日期為橫坐標，潛伏期為縱坐標繪制初始實驗期間的任務學習曲線，通常隨著每日訓練任務表現(xiàn)顯著提高。

五、數據統(tǒng)計與分析
根據研究人員的經驗，在轉棒測試中，大約8只動物的樣本量就能提供足夠的能力來檢測組平均值中10%到15%的差異。對于方差的統(tǒng)計同質性，小鼠的數量至少不應低于6只。

根據需要對數據進行方差分析，在適當的情況下，使用組間重復測量比較。對于事后分析，TukeyHSD測試用于確定組之間的成對差異，Dunnetts測試用于確定給定數據集與該數據集的控制值之間的顯著差異。當存在顯著的相互作用時，使用Sidak檢驗在組間進行一系列獨立的事后兩兩比較。差異在P＜0.05時被認為是顯著的。數據以平均值±標準誤表示。

六、注意事項
1.小鼠五到八只為一籠，飼養(yǎng)在溫度，濕度和光受控的環(huán)境中。保持12小時光/暗循環(huán)，早上8點亮燈。飼養(yǎng)室和實驗室的溫度保持在20±2°C,相對濕度為60%。除非在實驗過程中，平時小鼠可以隨意獲得食物和水。盡一切努力盡量減少動物的數量及其痛苦。

2.在行為測試之前，撫摩大鼠和小鼠是很重要的（所有組中的所有動物都以相同的方式撫摩到相同的程度）。這將使動物克服會對表現(xiàn)產生重大影響的自然恐懼和焦慮反應。

3.在測試開始之前，將動物送至行為測試室，讓它們不受干擾地適應30分鐘，然后稱重并記錄。測試可以在上午8點至下午4點之間進行，重要是是保持不同測試日的測試時間點一致。

4.不同小鼠品系獲得穩(wěn)定的基線表現(xiàn)水平所需的訓練量有所不同，但長時間暴露于逐漸增加的旋轉速度的一般原則是適用的。在訓練過程中，如果該方案對所使用的特定小鼠品系來說太累，可能有必要允許小鼠休息，休息15分鐘通常是足夠的。

5.所需的試驗次數可能因使用的小鼠品系而有所不同。在腦區(qū)損毀或遺傳性疾病模型的小鼠中，建議進行一次以上的試驗，因為單個實驗動物的分數通常有更大的差異。類似地，在縱向研究中，如果小鼠有一段時間沒有進行過測試了，第一次試驗可以作為提醒，在這種情況下，可能需要3次或4次試驗，可采用后2次或3次數據的數據分析。

6.實驗時轉棒速度的設計應考慮到疾病的嚴重程度。應該至少有一個較慢的速度，使大多數小鼠能夠保持在旋轉桿上。理想情況下，后續(xù)的速度應該產生一個代表疾病或其他處理因素（如給藥測試）嚴重程度的數據曲線。無法進行任務的比例應低于10%。隨著動物在疾病的后期變得更加虛弱，這種情況可能會增加。

7.最好在開始研究之前選擇重新測試的頻率。例如，如果正在研究一種測試化合物的短期影響，那么一次測試可能就足夠了。然而，如果正在調查復合治療、損毀或其他治療的長期影響，或者如果確定慢性表型，最好在幾周內每周進行重新測試，或連續(xù)幾個月每月進行重新測試。因此，在開始主要研究之前，通常需要進行預實驗來確定適當的實驗設計、測試頻率、發(fā)病年齡和表型持續(xù)時間。

8.一定要在每只被測試小鼠之間對設備進行清潔和消毒。小鼠經常在旋轉桿上小便和排便。桿子上的尿液和糞便會損害其他測試小鼠的表現(xiàn)。因此，經常清洗儀器是很重要的。

9.實驗室環(huán)境在測試期間應保持溫度、濕度和光強度不變。