實(shí)時(shí)活細(xì)胞成像技術(shù)在臨床醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用
先天性心臟病等心臟大血管疾病患者需要外科手術(shù)治療。心臟外科手術(shù)需要在心臟停跳狀態(tài)下進(jìn)行，而在心臟停跳過程中，不可避免地會(huì)出現(xiàn)不同程度的心肌損傷。應(yīng)用心臟停搏液不僅可以在手術(shù)過程中誘導(dǎo)心臟快速停跳、保持心臟停跳期間的心臟靜止?fàn)顟B(tài)、縮短心臟停跳時(shí)間，更大限度減少心肌損傷、維護(hù)正常的心臟功能，其優(yōu)劣還可以直接影響手術(shù)效果。目前，許多臨床試驗(yàn)比較了不同的心臟停搏液和心臟保護(hù)方案，但鮮有文章對(duì)體外條件培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行研究。
本研究采用新一代活細(xì)胞實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)成像及功能分析系統(tǒng)CellCyte X， 對(duì)作為體外模型的大鼠心肌細(xì)胞進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間成像和分析，評(píng)估了St.ThomasⅡ型心臟停搏液（ST2C）的可能用途以及細(xì)胞效應(yīng)，并且預(yù)估了心臟細(xì)胞的安全暴露時(shí)間，這個(gè)結(jié)果對(duì)心臟保護(hù)和心臟外科手術(shù)中選擇合適的方案提供了十分有意義的參考價(jià)值。
實(shí)驗(yàn)方法
將大鼠心肌細(xì)胞H9C2與冷停搏液共孵育24小時(shí)。孵育后，使用改良的 Ellman’s法、Ki67以及增殖細(xì)胞核抗原表達(dá)（PCNA）在置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中的活細(xì)胞成像平臺(tái)CellCyte X上測(cè)定細(xì)胞的活力、匯合性、細(xì)胞大小、巰基水平。另外通過超微結(jié)構(gòu)（TEM）研究和全斷層3D成像，觀察對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
1.細(xì)胞活力、匯合性和體積
ST2C的效果通過對(duì)H9C2細(xì)胞生存能力、匯合性和體積的分析得到了驗(yàn)證。
CellCyte X成像研究表明，短時(shí)間的暴露不會(huì)影響細(xì)胞的生存和匯合（圖1）。在2h時(shí)細(xì)胞的活力是對(duì)照未處理細(xì)胞的50%以上（圖1a）。匯流分析表明4h為終止時(shí)間，此后匯流開始下降（圖1b）。細(xì)胞體積分析表明暴露于心臟停搏液的細(xì)胞體積增加，腫脹，并在24小時(shí)內(nèi)保持不變（圖1c）。同時(shí)，我們觀察到了初始細(xì)胞體積的差異，這可能與實(shí)驗(yàn)程序方案有關(guān)，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞在測(cè)量前暴露于停搏液ST2C 10-15分鐘，短暫的預(yù)孵育時(shí)間可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞腫脹并保持24小時(shí)，我們觀察到正常的細(xì)胞體積在同一時(shí)間內(nèi)保持不變。
2.心臟停搏液對(duì)心肌細(xì)胞形態(tài)的影響
超微結(jié)構(gòu)（TEM）將暴露于ST2C后的細(xì)胞可視化（圖2）。用ST2C孵育1h后，與對(duì)照未處理細(xì)胞相比，心肌細(xì)胞線粒體有輕微病理變化（圖2b）。2h時(shí)線粒體的嵴輕微腫脹，這似乎與細(xì)胞體積結(jié)果相符，但細(xì)胞核顯示出正常的、未受影響的大小和形狀。此外我們觀察到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕微腫脹（圖2c）。與ST2C孵育24小時(shí)后，形成空泡和髓磷脂體，其中一些含有電子致密物質(zhì)（圖2d），與未暴露的對(duì)照細(xì)胞相比，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體顯示出正常的形態(tài)。這些結(jié)果表明ST2C對(duì)H9C2細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響具有時(shí)間依賴性。
圖3展示了H9C2細(xì)胞的三維視圖，可見無擾動(dòng)形態(tài)。和TEM研究類似，只有更長(zhǎng)的孵育時(shí)間才導(dǎo)致空泡化增加。接著，在24小時(shí)后測(cè)量巰基的水平，如圖4所示，暴露的時(shí)間越長(zhǎng)，對(duì)H9C2細(xì)胞越有害。觀察到ST2C顯著增加了SH組的水平，這可能與體積增加和細(xì)胞腫脹有關(guān)。然后通過免疫染色反應(yīng)來可視化，表1和表2顯示暴露于ST2C 24h后增殖標(biāo)記物PCNA和Ki67表達(dá)增加。
PCNA分析表明，暴露于ST2C暴露24h后發(fā)生染色反應(yīng)的細(xì)胞數(shù)量增加。在Ki67的情況下，我們可以在所有情況下幾乎100%的細(xì)胞中檢測(cè)到免疫染色反應(yīng)，其中24h時(shí)免疫染色反應(yīng)最強(qiáng)烈。
圖2.H9C2細(xì)胞的透射電鏡圖 （a）未處理對(duì)照；（b）1h后；（c） 2h和（d）24h使用基于ST2的心臟麻痹。C： 細(xì)胞質(zhì)M：線粒體，N：細(xì)胞核，ER：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，GA高爾基體；MB髓鞘；V空泡；L-溶酶體。
圖3. H9C2細(xì)胞全息層析顯微成像 （a)未經(jīng)處理對(duì)照；（b）暴露于ST2C 1h后；和（c）暴露于ST2C 24h。DAPI標(biāo)記物染色的藍(lán)色細(xì)胞核
圖4.用ST2C孵育24小時(shí)后，大鼠成肌細(xì)胞中作為蛋白質(zhì)損傷標(biāo)志物的巰基（SH-）水平。數(shù)據(jù)以µM/L蛋白質(zhì)表示，并以平均值±SD表示。*p<0.05。
表1.與ST2C孵育后H9C2細(xì)胞中PCNA表達(dá)的分析（*p<0.05）
表2.與ST2C孵育后H9C2細(xì)胞中Ki67表達(dá)的分析（*p<0.05）
實(shí)驗(yàn)結(jié)論
使用活細(xì)胞成像平臺(tái)CellCyte X 對(duì)體外模型研究表明，基于St.ThomasⅡ型心臟停搏液（ST2C）可以通過增加蛋白二硫化物和增殖標(biāo)記物（PCNA和Ki67）來保護(hù)和維持H9C2大鼠心肌細(xì)胞，且不會(huì)對(duì)形態(tài)學(xué)造成顯著的形態(tài)學(xué)變化。但是對(duì)于敏感的新生兒成肌細(xì)胞，保護(hù)時(shí)間限制在4小時(shí)內(nèi)。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，St.ThomasⅡ型心臟停搏液對(duì)保護(hù)心肌細(xì)胞有一定的作用，并且是一種經(jīng)濟(jì)且簡(jiǎn)單的解決方案。
CellCyte X 在臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的成像優(yōu)勢(shì)
新一代活細(xì)胞實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)成像及功能分析系統(tǒng)CellCyte X可以為臨床醫(yī)學(xué)提供自動(dòng)化的、連續(xù)的動(dòng)態(tài)細(xì)胞生長(zhǎng)分析:
一、提高細(xì)胞活率：可以內(nèi)置在任何廠牌的培養(yǎng)箱中，降低了實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)細(xì)胞的干擾
二、實(shí)時(shí)收集與分析數(shù)據(jù)：在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，可實(shí)時(shí)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行收集與處理
三、通量高：可同時(shí)放置6塊微孔板，更大限度滿足您對(duì)實(shí)驗(yàn)通量的需求
四、開放式設(shè)計(jì)：便于對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境的維持，提高了實(shí)驗(yàn)環(huán)境的可控性與更佳的細(xì)胞狀態(tài)
五、軟件平臺(tái)簡(jiǎn)潔直觀：直觀的成像與分析界面設(shè)計(jì)，方便使用者學(xué)習(xí)與操作，人人都可輕易上手
六、三通道熒光：增強(qiáng)的輪廓成像模式，除了明場(chǎng)還有紅、藍(lán)、綠3色熒光通道，讓實(shí)驗(yàn)可進(jìn)行多重復(fù)用
七、數(shù)據(jù)分析功能強(qiáng)大：每次實(shí)驗(yàn)可根據(jù)需求采集存儲(chǔ)數(shù)千張五百萬像素的高清圖像
八、設(shè)計(jì)緊湊：儀器結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)緊湊，易于安裝與維護(hù)，大幅降低了維護(hù)成本
如果您想了解更多，歡迎聯(lián)系我們。
本研究采用新一代活細(xì)胞實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)成像及功能分析系統(tǒng)CellCyte X， 對(duì)作為體外模型的大鼠心肌細(xì)胞進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間成像和分析，評(píng)估了St.ThomasⅡ型心臟停搏液（ST2C）的可能用途以及細(xì)胞效應(yīng)，并且預(yù)估了心臟細(xì)胞的安全暴露時(shí)間，這個(gè)結(jié)果對(duì)心臟保護(hù)和心臟外科手術(shù)中選擇合適的方案提供了十分有意義的參考價(jià)值。
實(shí)驗(yàn)方法
將大鼠心肌細(xì)胞H9C2與冷停搏液共孵育24小時(shí)。孵育后，使用改良的 Ellman’s法、Ki67以及增殖細(xì)胞核抗原表達(dá)（PCNA）在置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中的活細(xì)胞成像平臺(tái)CellCyte X上測(cè)定細(xì)胞的活力、匯合性、細(xì)胞大小、巰基水平。另外通過超微結(jié)構(gòu)（TEM）研究和全斷層3D成像，觀察對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
1.細(xì)胞活力、匯合性和體積
ST2C的效果通過對(duì)H9C2細(xì)胞生存能力、匯合性和體積的分析得到了驗(yàn)證。
CellCyte X成像研究表明，短時(shí)間的暴露不會(huì)影響細(xì)胞的生存和匯合（圖1）。在2h時(shí)細(xì)胞的活力是對(duì)照未處理細(xì)胞的50%以上（圖1a）。匯流分析表明4h為終止時(shí)間，此后匯流開始下降（圖1b）。細(xì)胞體積分析表明暴露于心臟停搏液的細(xì)胞體積增加，腫脹，并在24小時(shí)內(nèi)保持不變（圖1c）。同時(shí)，我們觀察到了初始細(xì)胞體積的差異，這可能與實(shí)驗(yàn)程序方案有關(guān)，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞在測(cè)量前暴露于停搏液ST2C 10-15分鐘，短暫的預(yù)孵育時(shí)間可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞腫脹并保持24小時(shí)，我們觀察到正常的細(xì)胞體積在同一時(shí)間內(nèi)保持不變。
圖1.ST2C對(duì)H9C2細(xì)胞的影響
- MTT法測(cè)定存活率；（b）細(xì)胞匯合性；（c）暴露24h后的細(xì)胞體積；可行性結(jié)果表示為平均值±SD。單向方差分析：*p<0.05，**p>0.005。
2.心臟停搏液對(duì)心肌細(xì)胞形態(tài)的影響
超微結(jié)構(gòu)（TEM）將暴露于ST2C后的細(xì)胞可視化（圖2）。用ST2C孵育1h后，與對(duì)照未處理細(xì)胞相比，心肌細(xì)胞線粒體有輕微病理變化（圖2b）。2h時(shí)線粒體的嵴輕微腫脹，這似乎與細(xì)胞體積結(jié)果相符，但細(xì)胞核顯示出正常的、未受影響的大小和形狀。此外我們觀察到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕微腫脹（圖2c）。與ST2C孵育24小時(shí)后，形成空泡和髓磷脂體，其中一些含有電子致密物質(zhì)（圖2d），與未暴露的對(duì)照細(xì)胞相比，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體顯示出正常的形態(tài)。這些結(jié)果表明ST2C對(duì)H9C2細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響具有時(shí)間依賴性。
圖3展示了H9C2細(xì)胞的三維視圖，可見無擾動(dòng)形態(tài)。和TEM研究類似，只有更長(zhǎng)的孵育時(shí)間才導(dǎo)致空泡化增加。接著，在24小時(shí)后測(cè)量巰基的水平，如圖4所示，暴露的時(shí)間越長(zhǎng)，對(duì)H9C2細(xì)胞越有害。觀察到ST2C顯著增加了SH組的水平，這可能與體積增加和細(xì)胞腫脹有關(guān)。然后通過免疫染色反應(yīng)來可視化，表1和表2顯示暴露于ST2C 24h后增殖標(biāo)記物PCNA和Ki67表達(dá)增加。
PCNA分析表明，暴露于ST2C暴露24h后發(fā)生染色反應(yīng)的細(xì)胞數(shù)量增加。在Ki67的情況下，我們可以在所有情況下幾乎100%的細(xì)胞中檢測(cè)到免疫染色反應(yīng)，其中24h時(shí)免疫染色反應(yīng)最強(qiáng)烈。
圖2.H9C2細(xì)胞的透射電鏡圖 （a）未處理對(duì)照；（b）1h后；（c） 2h和（d）24h使用基于ST2的心臟麻痹。C： 細(xì)胞質(zhì)M：線粒體，N：細(xì)胞核，ER：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，GA高爾基體；MB髓鞘；V空泡；L-溶酶體。
圖3. H9C2細(xì)胞全息層析顯微成像 （a)未經(jīng)處理對(duì)照；（b）暴露于ST2C 1h后；和（c）暴露于ST2C 24h。DAPI標(biāo)記物染色的藍(lán)色細(xì)胞核
圖4.用ST2C孵育24小時(shí)后，大鼠成肌細(xì)胞中作為蛋白質(zhì)損傷標(biāo)志物的巰基（SH-）水平。數(shù)據(jù)以µM/L蛋白質(zhì)表示，并以平均值±SD表示。*p<0.05。
表1.與ST2C孵育后H9C2細(xì)胞中PCNA表達(dá)的分析（*p<0.05）
表2.與ST2C孵育后H9C2細(xì)胞中Ki67表達(dá)的分析（*p<0.05）
實(shí)驗(yàn)結(jié)論
使用活細(xì)胞成像平臺(tái)CellCyte X 對(duì)體外模型研究表明，基于St.ThomasⅡ型心臟停搏液（ST2C）可以通過增加蛋白二硫化物和增殖標(biāo)記物（PCNA和Ki67）來保護(hù)和維持H9C2大鼠心肌細(xì)胞，且不會(huì)對(duì)形態(tài)學(xué)造成顯著的形態(tài)學(xué)變化。但是對(duì)于敏感的新生兒成肌細(xì)胞，保護(hù)時(shí)間限制在4小時(shí)內(nèi)。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，St.ThomasⅡ型心臟停搏液對(duì)保護(hù)心肌細(xì)胞有一定的作用，并且是一種經(jīng)濟(jì)且簡(jiǎn)單的解決方案。
CellCyte X 在臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的成像優(yōu)勢(shì)
圖5. CellCyte X儀器
新一代活細(xì)胞實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)成像及功能分析系統(tǒng)CellCyte X可以為臨床醫(yī)學(xué)提供自動(dòng)化的、連續(xù)的動(dòng)態(tài)細(xì)胞生長(zhǎng)分析:
一、提高細(xì)胞活率：可以內(nèi)置在任何廠牌的培養(yǎng)箱中，降低了實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)細(xì)胞的干擾
二、實(shí)時(shí)收集與分析數(shù)據(jù)：在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，可實(shí)時(shí)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行收集與處理
三、通量高：可同時(shí)放置6塊微孔板，更大限度滿足您對(duì)實(shí)驗(yàn)通量的需求
四、開放式設(shè)計(jì)：便于對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境的維持，提高了實(shí)驗(yàn)環(huán)境的可控性與更佳的細(xì)胞狀態(tài)
五、軟件平臺(tái)簡(jiǎn)潔直觀：直觀的成像與分析界面設(shè)計(jì)，方便使用者學(xué)習(xí)與操作，人人都可輕易上手
六、三通道熒光：增強(qiáng)的輪廓成像模式，除了明場(chǎng)還有紅、藍(lán)、綠3色熒光通道，讓實(shí)驗(yàn)可進(jìn)行多重復(fù)用
七、數(shù)據(jù)分析功能強(qiáng)大：每次實(shí)驗(yàn)可根據(jù)需求采集存儲(chǔ)數(shù)千張五百萬像素的高清圖像
八、設(shè)計(jì)緊湊：儀器結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)緊湊，易于安裝與維護(hù)，大幅降低了維護(hù)成本
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