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基于轉(zhuǎn)座酶和m5C位點(diǎn)酶學(xué)轉(zhuǎn)化方法的eccDNA甲基化測序技術(shù)的應(yīng)用
文章導(dǎo)讀
近年來，eccDNA（染色體外環(huán)狀DNA）連登《Nature》《Cell》等期刊，徹底顛覆了人們對基因遺傳的傳統(tǒng)認(rèn)知(顛覆性發(fā)現(xiàn)：癌基因竟不在染色體上 環(huán)狀DNA連登Nature，Cell！)，成為了極具潛力的科研新熱點(diǎn)（2020國自然研究熱點(diǎn)—eccDNA的前世今生）。
近期，NIPT之父盧煜明教授基于轉(zhuǎn)座酶和m5C位點(diǎn)酶學(xué)轉(zhuǎn)化方法開發(fā)出了eccDNA甲基化測序技術(shù)，并揭示了孕婦血漿中的胎兒eccDNA甲基化狀況，為eccDNA的深入研究及新型分子標(biāo)志物的開發(fā)提供了新的技術(shù)手段。
作為國內(nèi)提供eccDNA測序服務(wù)的公司，云序生物一直是eccDNA領(lǐng)域的領(lǐng)跑者。通過嚴(yán)謹(jǐn)?shù)募夹g(shù)開發(fā)和質(zhì)控，云序再次全國首發(fā)：eccDNA甲基化測序服務(wù)（全國首發(fā)！云序再推eccDNA重磅新品：eccDNA甲基化測序！）！
我們就為大家解讀這篇eccDNA甲基化的文章，以及介紹云序生物eccDNA甲基化測序及相關(guān)產(chǎn)品。 
發(fā)表雜志：Clinical Chemistry
影響因子：7.292
發(fā)表日期：2021.2
文章鏈接：Characteristics of Fetal Extrachromosomal Circular DNA in Maternal Plasma: Methylation Status and Clearance
作者采集了產(chǎn)后不同時間點(diǎn)的母體血漿，使用限制性外切酶對其中的eccDNA進(jìn)行了純化富集，然后構(gòu)建了5-mC-Tn5轉(zhuǎn)座子將eccDNA剪切成線性分子。通過酶處理使未發(fā)生5mC甲基化的C轉(zhuǎn)化為U，再進(jìn)行建庫及高通量測序，分析得到eccDNA上發(fā)生甲基化的位點(diǎn)。
2. eccDNA和甲基化位點(diǎn)的分布
作者展示了血漿eccDNA的長度分布集中在202bp和338bp左右，胎兒來源的eccDNA比母體來源的eccDNA長度更短，甲基化密度更低�；蚝突蜷g來源的EccDNA上CpG島甲基化密度無顯著差別，線性DNA和eccDNA的甲基化密度也未發(fā)現(xiàn)明顯差別。另外，作者還用了對5mC敏感和不敏感的兩種限制性內(nèi)切酶驗(yàn)證了胎兒來源的eccDNA甲基化程度比母體來源eccDNA低。
3. eccDNA長度與甲基化密度的關(guān)聯(lián)
作者分析測序數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，小分子eccDNA的甲基化密度低于長分子eccDNA。通過MspI/HpaII消化實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了這一趨勢。
4. 胎兒eccDNA在母體循環(huán)中的清除
在分娩后0,30,60,120分鐘分別采取母體血漿，測序發(fā)現(xiàn)胎兒來源的eccDNA和線性DNA占比迅速降低，兩者的半衰期相似。
云序生物eccDNA甲基化測序
eccDNA大量存在與正常體細(xì)胞和癌細(xì)胞中，其上染色質(zhì)高度開放，攜帶基因能夠大量表達(dá)，可以影響細(xì)胞生命活動，在腫瘤發(fā)生發(fā)展機(jī)理研究中發(fā)揮著重大的潛在價值，并且可能成為一種新型特異的腫瘤標(biāo)志物。而DNA甲基化又能控制基因表達(dá)，在動植物的生長發(fā)育過程中發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)控作用，并且與多種人類疾病密切相關(guān)，是表觀遺傳學(xué)研究的熱點(diǎn)。
云序生物作為追逐不斷創(chuàng)新的科技創(chuàng)新型企業(yè)，在推出eccDNA測序的基礎(chǔ)上，再次推出eccDNA甲基化測序服務(wù)，助力探索研究熱點(diǎn)。
單堿基分辨的eccDNA甲基化分析
2. 加接頭：通過轉(zhuǎn)座酶打開eccDNA的環(huán)形結(jié)構(gòu)，并在DNA片段的兩端加上接頭。
3. 末端修復(fù)：通過Klenow酶修復(fù)轉(zhuǎn)座產(chǎn)物的末端缺口。
4. C-U轉(zhuǎn)化：通過溫和的酶轉(zhuǎn)化法，將未甲基化的胞嘧啶（C）高效地轉(zhuǎn)化為尿嘧啶（U）。
5. PCR擴(kuò)增：對轉(zhuǎn)化后產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增及純化。
6. 上機(jī)測序：純化后文庫質(zhì)檢合格后進(jìn)行上機(jī)測序。
云序eccDNA甲基化測序?qū)嵗故?/strong>
實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目：血漿eccDNA甲基化測序
A. 質(zhì)控
1. 血漿cfDNA Qubit定量
通過Qubit熒光定量儀檢測摻入樣品DNA的特異熒光染料信號，從而對樣品進(jìn)行精確定量。
2. 文庫2100質(zhì)控
通過Agilent生物分析儀對測序文庫進(jìn)行質(zhì)控。
3. FastQC質(zhì)控
通過FastQC軟件進(jìn)行測序數(shù)據(jù)質(zhì)控。
4. Read統(tǒng)計(jì)及轉(zhuǎn)化率
對測序堿基質(zhì)量(Q30)，Read及C-U轉(zhuǎn)化率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。
B. 數(shù)據(jù)展示
1. eccDNA的識別及甲基化水平
通過軟件識別eccDNA的染色體坐標(biāo)，長度及表達(dá)量
ecc_chr: eccDNA的染色體
ecc_start: eccDNA的起始位點(diǎn)
ecc_end: eccDNA的終止位點(diǎn)
ecc_location: eccDNA的染色體坐標(biāo)
ecc_length: eccDNA的長度
T1，T2: 不同樣品中某個eccDNA對應(yīng)的原始split reads數(shù)目
Meth_Level_T1,T2: 不同樣品中某個eccDNA的甲基化水平
2. eccDNA的基因注釋
對eccDNA所在位置的蛋白編碼基因的位置，基因名，基因ID等信息進(jìn)行注釋
chr, start, end: eccDNA所在區(qū)域的蛋白編碼基因的基因組位置信息
gene_id: eccDNA所在區(qū)域的蛋白編碼基因的gene ID
gene_name: eccDNA所在區(qū)域的蛋白編碼基因的基因名
strand: eccDNA所在區(qū)域的蛋白編碼基因所處的正負(fù)鏈信息
overlap: eccDNA與蛋白編碼基因的重疊區(qū)域
3. eccDNA長度分布圖
eccDNA的長度分布圖表明：eccDNA在兩個區(qū)域富集，一是~200bp的區(qū)域，另一個是300-450bp的區(qū)域。
4. eccDNA甲基化水平統(tǒng)計(jì)
不同功能區(qū)域的eccDNA的甲基化水平統(tǒng)計(jì)
eccDNA甲基化測序樣品要求：
cfDNA: > 50 ng
血漿：> 5 mL
細(xì)胞：> 2 x 107
組織：> 100 mg
其他樣品類型咨詢021-64878766當(dāng)?shù)劁N售
云序生物eccDNA
1. 組織細(xì)胞eccDNA測序
基于circle-seq方法,利用A&A Biotechnology離子交換柱高效富集基因組DNA中的eccDNA，利用核酸酶消化除去殘余線性DNA, 通過滾環(huán)擴(kuò)增獲得大量的eccDNA拷貝,再利用NGS測序高通量地檢測樣品中所有的環(huán)狀DNA分子。
2. 血清血漿eccDNA測序
利用Tn5轉(zhuǎn)座酶打開環(huán)狀結(jié)構(gòu)，高效檢測循環(huán)系統(tǒng)中微量的eccDNA分子。
3. eccDNA甲基化測序
利用Tn5轉(zhuǎn)座酶打開環(huán)狀結(jié)構(gòu)，用酶轉(zhuǎn)化法將未甲基化的胞嘧啶（C）高效地轉(zhuǎn)化為尿嘧啶（U）。實(shí)現(xiàn)單堿基分辨率的eccDNA甲基化檢測
4. eccDNA sanger測序驗(yàn)證
針對eccDNA的連接位點(diǎn)設(shè)計(jì)反向引物，PCR后sanger測序驗(yàn)證連接位點(diǎn)處序列。
近年來，eccDNA（染色體外環(huán)狀DNA）連登《Nature》《Cell》等期刊，徹底顛覆了人們對基因遺傳的傳統(tǒng)認(rèn)知(顛覆性發(fā)現(xiàn)：癌基因竟不在染色體上 環(huán)狀DNA連登Nature，Cell！)，成為了極具潛力的科研新熱點(diǎn)（2020國自然研究熱點(diǎn)—eccDNA的前世今生）。
近期，NIPT之父盧煜明教授基于轉(zhuǎn)座酶和m5C位點(diǎn)酶學(xué)轉(zhuǎn)化方法開發(fā)出了eccDNA甲基化測序技術(shù)，并揭示了孕婦血漿中的胎兒eccDNA甲基化狀況，為eccDNA的深入研究及新型分子標(biāo)志物的開發(fā)提供了新的技術(shù)手段。
作為國內(nèi)提供eccDNA測序服務(wù)的公司，云序生物一直是eccDNA領(lǐng)域的領(lǐng)跑者。通過嚴(yán)謹(jǐn)?shù)募夹g(shù)開發(fā)和質(zhì)控，云序再次全國首發(fā)：eccDNA甲基化測序服務(wù)（全國首發(fā)！云序再推eccDNA重磅新品：eccDNA甲基化測序！）！
我們就為大家解讀這篇eccDNA甲基化的文章，以及介紹云序生物eccDNA甲基化測序及相關(guān)產(chǎn)品。
影響因子：7.292
發(fā)表日期：2021.2
文章鏈接：Characteristics of Fetal Extrachromosomal Circular DNA in Maternal Plasma: Methylation Status and Clearance
文章內(nèi)容
1. eccDNA甲基化鑒定實(shí)驗(yàn)方法作者采集了產(chǎn)后不同時間點(diǎn)的母體血漿，使用限制性外切酶對其中的eccDNA進(jìn)行了純化富集，然后構(gòu)建了5-mC-Tn5轉(zhuǎn)座子將eccDNA剪切成線性分子。通過酶處理使未發(fā)生5mC甲基化的C轉(zhuǎn)化為U，再進(jìn)行建庫及高通量測序，分析得到eccDNA上發(fā)生甲基化的位點(diǎn)。
2. eccDNA和甲基化位點(diǎn)的分布
作者展示了血漿eccDNA的長度分布集中在202bp和338bp左右，胎兒來源的eccDNA比母體來源的eccDNA長度更短，甲基化密度更低�；蚝突蜷g來源的EccDNA上CpG島甲基化密度無顯著差別，線性DNA和eccDNA的甲基化密度也未發(fā)現(xiàn)明顯差別。另外，作者還用了對5mC敏感和不敏感的兩種限制性內(nèi)切酶驗(yàn)證了胎兒來源的eccDNA甲基化程度比母體來源eccDNA低。
3. eccDNA長度與甲基化密度的關(guān)聯(lián)
作者分析測序數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，小分子eccDNA的甲基化密度低于長分子eccDNA。通過MspI/HpaII消化實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了這一趨勢。
4. 胎兒eccDNA在母體循環(huán)中的清除
在分娩后0,30,60,120分鐘分別采取母體血漿，測序發(fā)現(xiàn)胎兒來源的eccDNA和線性DNA占比迅速降低，兩者的半衰期相似。
云序生物eccDNA甲基化測序
eccDNA大量存在與正常體細(xì)胞和癌細(xì)胞中，其上染色質(zhì)高度開放，攜帶基因能夠大量表達(dá)，可以影響細(xì)胞生命活動，在腫瘤發(fā)生發(fā)展機(jī)理研究中發(fā)揮著重大的潛在價值，并且可能成為一種新型特異的腫瘤標(biāo)志物。而DNA甲基化又能控制基因表達(dá)，在動植物的生長發(fā)育過程中發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)控作用，并且與多種人類疾病密切相關(guān)，是表觀遺傳學(xué)研究的熱點(diǎn)。
云序生物作為追逐不斷創(chuàng)新的科技創(chuàng)新型企業(yè)，在推出eccDNA測序的基礎(chǔ)上，再次推出eccDNA甲基化測序服務(wù)，助力探索研究熱點(diǎn)。
技術(shù)優(yōu)勢：
一箭雙雕：同時檢測eccDNA及其甲基化狀況，節(jié)約樣品，性價比高單堿基分辨的eccDNA甲基化分析
實(shí)驗(yàn)流程
1. EccDNA富集：通過核酸外切酶 V 消化等手段，去除樣品中的線性DNA，從而達(dá)到富集eccDNA的目的。2. 加接頭：通過轉(zhuǎn)座酶打開eccDNA的環(huán)形結(jié)構(gòu)，并在DNA片段的兩端加上接頭。
3. 末端修復(fù)：通過Klenow酶修復(fù)轉(zhuǎn)座產(chǎn)物的末端缺口。
4. C-U轉(zhuǎn)化：通過溫和的酶轉(zhuǎn)化法，將未甲基化的胞嘧啶（C）高效地轉(zhuǎn)化為尿嘧啶（U）。
5. PCR擴(kuò)增：對轉(zhuǎn)化后產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增及純化。
6. 上機(jī)測序：純化后文庫質(zhì)檢合格后進(jìn)行上機(jī)測序。
云序eccDNA甲基化測序?qū)嵗故?/strong>
實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目：血漿eccDNA甲基化測序
A. 質(zhì)控
1. 血漿cfDNA Qubit定量
通過Qubit熒光定量儀檢測摻入樣品DNA的特異熒光染料信號，從而對樣品進(jìn)行精確定量。
2. 文庫2100質(zhì)控
通過Agilent生物分析儀對測序文庫進(jìn)行質(zhì)控。
3. FastQC質(zhì)控
通過FastQC軟件進(jìn)行測序數(shù)據(jù)質(zhì)控。
4. Read統(tǒng)計(jì)及轉(zhuǎn)化率
對測序堿基質(zhì)量(Q30)，Read及C-U轉(zhuǎn)化率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。
B. 數(shù)據(jù)展示
1. eccDNA的識別及甲基化水平
通過軟件識別eccDNA的染色體坐標(biāo)，長度及表達(dá)量
ecc_start: eccDNA的起始位點(diǎn)
ecc_end: eccDNA的終止位點(diǎn)
ecc_location: eccDNA的染色體坐標(biāo)
ecc_length: eccDNA的長度
T1，T2: 不同樣品中某個eccDNA對應(yīng)的原始split reads數(shù)目
Meth_Level_T1,T2: 不同樣品中某個eccDNA的甲基化水平
2. eccDNA的基因注釋
對eccDNA所在位置的蛋白編碼基因的位置，基因名，基因ID等信息進(jìn)行注釋
chr, start, end: eccDNA所在區(qū)域的蛋白編碼基因的基因組位置信息
gene_id: eccDNA所在區(qū)域的蛋白編碼基因的gene ID
gene_name: eccDNA所在區(qū)域的蛋白編碼基因的基因名
strand: eccDNA所在區(qū)域的蛋白編碼基因所處的正負(fù)鏈信息
overlap: eccDNA與蛋白編碼基因的重疊區(qū)域
3. eccDNA長度分布圖
eccDNA的長度分布圖表明：eccDNA在兩個區(qū)域富集，一是~200bp的區(qū)域，另一個是300-450bp的區(qū)域。
4. eccDNA甲基化水平統(tǒng)計(jì)
不同功能區(qū)域的eccDNA的甲基化水平統(tǒng)計(jì)
cfDNA: > 50 ng
血漿：> 5 mL
細(xì)胞：> 2 x 107
組織：> 100 mg
其他樣品類型咨詢021-64878766當(dāng)?shù)劁N售
云序生物eccDNA
1. 組織細(xì)胞eccDNA測序
基于circle-seq方法,利用A&A Biotechnology離子交換柱高效富集基因組DNA中的eccDNA，利用核酸酶消化除去殘余線性DNA, 通過滾環(huán)擴(kuò)增獲得大量的eccDNA拷貝,再利用NGS測序高通量地檢測樣品中所有的環(huán)狀DNA分子。
2. 血清血漿eccDNA測序
利用Tn5轉(zhuǎn)座酶打開環(huán)狀結(jié)構(gòu)，高效檢測循環(huán)系統(tǒng)中微量的eccDNA分子。
3. eccDNA甲基化測序
利用Tn5轉(zhuǎn)座酶打開環(huán)狀結(jié)構(gòu)，用酶轉(zhuǎn)化法將未甲基化的胞嘧啶（C）高效地轉(zhuǎn)化為尿嘧啶（U）。實(shí)現(xiàn)單堿基分辨率的eccDNA甲基化檢測
4. eccDNA sanger測序驗(yàn)證
針對eccDNA的連接位點(diǎn)設(shè)計(jì)反向引物，PCR后sanger測序驗(yàn)證連接位點(diǎn)處序列。
國自然熱點(diǎn)之eccDNA研究思路解析講座視頻
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標(biāo)簽：
環(huán)狀DNA
甲基化
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