介紹

在生物實(shí)驗(yàn)中要經(jīng)常要使用到的平行線分析(PLA)方法，當(dāng)無法直接檢測(cè)一個(gè)生物制品的活性而只能通過檢測(cè)其產(chǎn)生的效果時(shí)，PLA方法通常會(huì)被用來進(jìn)行效應(yīng)曲線的比較來獲得此制品的效果(Figure1)。如果對(duì)于兩種物質(zhì)其生物響應(yīng)相似或者在兩種不同的生物環(huán)境中同一種物質(zhì)產(chǎn)生相似的效應(yīng)曲線時(shí)，平行線分析法可以被用來進(jìn)行評(píng)價(jià)。評(píng)價(jià)平行性是計(jì)算化合物或藥物相對(duì)活性的前提，并且在很多生物應(yīng)用中如藥物活性比較、分析物鑒定、交叉反應(yīng)、干擾物質(zhì)、基質(zhì)補(bǔ)償、濃度估算和抑制效應(yīng)等應(yīng)用研究中。

當(dāng)兩條曲線被判定為平行時(shí)，其中一條曲線的函數(shù)可以通過通過另一條曲線的函數(shù)乘上一個(gè)比例系數(shù)向X軸的左邊或右邊變換獲得：f(x)=f(rx)，其中x是劑量，r是比例系數(shù)或相對(duì)活性。對(duì)于相對(duì)活性，一般將參考品(已知品)的活性設(shè)為1，可以使用一個(gè)比例系數(shù)可以將參考品的曲線變換為測(cè)試品(未知品)曲線，那么這比例系數(shù)則被稱之為測(cè)試品的相對(duì)活性。這個(gè)方法應(yīng)用于線性擬合的曲線非常合適，因?yàn)榫�性擬合的曲線在整個(gè)濃度范圍內(nèi)的曲線斜率是保持一致的(Figure2)�？墒菍�(duì)于非線性擬合曲線如4-參數(shù)和5-參數(shù)曲線，S形的濃度效應(yīng)曲線在整個(gè)測(cè)試濃度范圍內(nèi)具有變?cè)挼男甭手?Figure1)。

用于評(píng)價(jià)平行性的方法根據(jù)平行性假設(shè)的驗(yàn)證方法不同大致可以分為兩大類：效應(yīng)比較法和參數(shù)比較法。本文將對(duì)這兩大類方法進(jìn)行詳細(xì)解釋和介紹怎樣使用SoftMax® Pro 7軟件進(jìn)行平行性測(cè)試。我們建立了一個(gè)Protocol包括了使用F-檢驗(yàn)進(jìn)行F-檢驗(yàn)概率測(cè)試和使用卡芳-檢驗(yàn)進(jìn)行卡芳概率測(cè)試。另外，對(duì)于參數(shù)比較法，根據(jù)菲勒定理我們也建立了一個(gè)ParallelismTest的protocol放在SoftMaxProProtocol的庫(kù)內(nèi)。所有這些方法都可以被用于評(píng)價(jià)線性和非線性擬合曲線。

優(yōu)勢(shì)

- 一鍵點(diǎn)擊應(yīng)用通用約束型模型擬合
- 自動(dòng)計(jì)算相對(duì)活性、擬合參數(shù)和置信區(qū)間
- 預(yù)設(shè)各種平行線分析模板調(diào)用

平行性檢測(cè)

效應(yīng)比較法

生物系統(tǒng)經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)不符合預(yù)期的現(xiàn)象，并且數(shù)據(jù)會(huì)出現(xiàn)一些噪聲和波動(dòng)；因此，選擇正確的曲線擬合方式和權(quán)重因子，來消除這些噪聲和波動(dòng)是進(jìn)行平行性評(píng)價(jià)前的首要一步。如果選擇了一個(gè)不合適的擬合方式，那么可能在平行性評(píng)價(jià)系統(tǒng)內(nèi)引入偏差，進(jìn)而得出錯(cuò)誤的結(jié)論。

由于根據(jù)實(shí)際實(shí)驗(yàn)中的數(shù)據(jù)，很難獲得完全平行的擬合曲線，尤其對(duì)于非線性擬合回歸，而計(jì)算非平行曲線獲得相對(duì)活性是很困難的。在效應(yīng)比較法中，參考品和測(cè)試品的曲線會(huì)使用約束模型同時(shí)進(jìn)行擬合，在這個(gè)模型中，曲線被強(qiáng)制變?yōu)槠叫�；而在非約束模型中，兩條曲線會(huì)各自進(jìn)行擬合。通過統(tǒng)計(jì)學(xué)的方法，來比較約束模型和非約束模型兩種擬合度的差異，這個(gè)差異可能是由于非平行性造成的。

在約束模型中，用來描述曲線的所有參數(shù)都是一樣的，除了用來描述 X- 值的參數(shù)不一樣；線性擬合中，X- 值是指截距，非線性擬合中是指上、下漸近線之間的中值，也就是 EC₅₀ 值。SoftMax Pro 軟件具有計(jì)算線性擬合的相對(duì)活性，也可以使用約束性模型 ( 全局?jǐn)M合模型 ) 和獨(dú)立模型對(duì)非線性擬合曲線進(jìn)行評(píng)價(jià)和計(jì)算相對(duì)活性。

- ChiSquaredPLA (PlotName@GraphName): 返回被擬合曲線的卡芳統(tǒng)計(jì)值
- ChiProbabilityPLA (PlotName@GraphSection): 返回被擬合曲線的卡芳統(tǒng)計(jì)值概率分布值
- FStatPLA (PlotName@GraphSection):返回被擬合曲線的 F- 檢驗(yàn)值
- FProbPLA (PlotName@GraphSection):返回被擬合曲線的 F- 檢驗(yàn)值概率分布值

注：以上所有公式只有在曲線擬合選項(xiàng)置中的 Global Fit (PLA) 選項(xiàng)被使用的情況下才可以使用。PlotName@ GraphName 是曲線的全稱，包含圖表的名稱，例如，Plot#1@Graph#1 或 Std@Standardcurve。指定某一條曲線作為公式內(nèi)曲線是帶有主觀性的，實(shí)際上卡方值是從該圖表中的所有曲線數(shù)據(jù)計(jì)算而來的。名稱為“Parallel Line Analysis Using Ftest and Chi-squared Test”的模板，是根據(jù)這兩種統(tǒng)計(jì)學(xué)方法而建立的 SMP 模板。當(dāng)使用儀器直接獲取到數(shù)據(jù)或者從外部導(dǎo)入數(shù)據(jù)到模板中后，所有的計(jì)算過程會(huì)自動(dòng)進(jìn)行，并進(jìn)行零假設(shè)的評(píng)估，判斷曲線是否平行。

在這個(gè)模板中，F(xiàn)-檢驗(yàn)和卡芳檢驗(yàn)的概率值必須大于等于0.95才能認(rèn)定曲線是平行的。一般來說，這個(gè)設(shè)置的意思是指有95%的置信度該假設(shè)是成立的。置信程度是可以被調(diào)整的以適應(yīng)不同實(shí)驗(yàn)的接受水平。

虛假設(shè)測(cè)試

在效應(yīng)比較法中，平行性的計(jì)算通常是利用殘差平方和(RSSE)的函數(shù)來進(jìn)行的,以此來判斷約束性模型對(duì)數(shù)據(jù)的擬合效果，另外一個(gè)特殊的方法，則是根據(jù)附加平方和的分析來進(jìn)行。這個(gè)統(tǒng)計(jì)學(xué)回歸方法是方差分析(ANOVA)的一種形式，其中虛假設(shè)的是約束性模型是正確的或者說曲線是相互平行的。虛假設(shè)的驗(yàn)證，可以使用各種不同的統(tǒng)計(jì)學(xué)技術(shù)，包括概率的F-檢驗(yàn)或卡方檢驗(yàn)。在這兩種方法中，概率值會(huì)被計(jì)算出來，通常這個(gè)值介于0-1之間，當(dāng)這個(gè)值接近1時(shí)，意味著曲線間的平行性在增大。需要注意的是，F(xiàn)-檢驗(yàn)是有一定缺陷的，此法對(duì)于對(duì)獨(dú)立模型擬合度很高的曲線可能產(chǎn)生假陽性判斷或者對(duì)于獨(dú)立模型擬合度很低的曲線產(chǎn)生假陰性的判斷。這兩種方法都被收錄進(jìn)了SoftMax Pro軟件當(dāng)中，檢驗(yàn)值和概率值計(jì)算可以通過軟件內(nèi)的以下公式方便的獲得：

噪聲和權(quán)重

噪聲是指檢測(cè)響應(yīng)的隨機(jī)變化，當(dāng)進(jìn)行平行線評(píng)價(jià)時(shí)這是需要考慮的重要因素，因?yàn)樗鼤?huì)影響檢測(cè)平行性的能力。在高噪聲的情況下，平行性計(jì)算值由于由于受噪聲的影響過大，因此無法再正確的反應(yīng)非平行性的程度。

對(duì)于 F- 檢驗(yàn)和卡方檢驗(yàn)法這兩種方法，在計(jì)算各自的概率值的過程中對(duì)于不同噪聲水平的處理能力是不同的。F- 檢驗(yàn)的概率值不受此因素影響，但是卡芳檢驗(yàn)概率計(jì)算值則高度依賴于噪聲水平并要求對(duì)于數(shù)據(jù)方差進(jìn)行準(zhǔn)確的估算。因此，對(duì)于卡方檢驗(yàn)法需要進(jìn)行反方差權(quán)重設(shè)置。

如在“Selecting the best weightingfactor in SoftMax Pro 7”此篇應(yīng)用資料里討論的，生物實(shí)驗(yàn)一般在在曲線的上半部分會(huì)有較大的方差。在無權(quán)重的回歸分析中，平行性的結(jié)果會(huì)主要受曲線的上半部分的數(shù)據(jù)點(diǎn)影響，而曲線的下半部分的數(shù)據(jù)點(diǎn)在對(duì)于平行性結(jié)果的影響不大。

在軟件的模板中，權(quán)重因子的設(shè)置使用方差的倒數(shù)，但是根據(jù)情況可以調(diào)整為更合適的權(quán)重公式。另外，在 SoftMax Pro 6.5或更高版本中，可以直接進(jìn)行方差的倒數(shù)權(quán)重項(xiàng)的設(shè)置 (Figure 4G)�？ǚ綑z驗(yàn)方法中，參數(shù)的置信區(qū)間設(shè)置項(xiàng) (Figure 4H) 只有在‘Weights are Inverse Variances’項(xiàng)被選擇的情況下才能使用。最佳的權(quán)重因子的設(shè)置會(huì)保證結(jié)果是主要來源于所有變化的數(shù)據(jù)點(diǎn)。

如何在SoftMax Pro使用PLA

在 SoftMax Pro 7 軟件中，PLA 可以在除了“point-to-point”,“l(fā)og-logit”和“cubic spline”三種擬合方式之外的所有通用曲線擬合方式下使用。在圖表部分，所有曲線具有一個(gè)共同的曲線擬合方程，PLA 的具體使用設(shè)置請(qǐng)見 Figure 4。

參數(shù)比較法

與響應(yīng)比較法直接評(píng)價(jià)不同劑量曲線下的響應(yīng)差異不同，參數(shù)比較法會(huì)各自獨(dú)立地對(duì)非約束模型下的各個(gè)曲線的參數(shù)進(jìn)行比較，并參考大概置信區(qū)間；參數(shù)對(duì)必須落在規(guī)定置信水平下的置信區(qū)間內(nèi)。這種方法叫做等效測(cè)試和平行性小于規(guī)定閾值的測(cè)試法。歐洲藥典中使用的斜率比值法就是等效測(cè)試法的一個(gè)例子。

菲勒定理

菲勒定理使用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法計(jì)算兩個(gè)參數(shù)比值的置信區(qū)間，使用tInv函數(shù)進(jìn)行比值的計(jì)算，因此遵循帶自由度的t-分布，其概率為p。SoftMaxPro軟件的統(tǒng)計(jì)學(xué)公式，可以計(jì)算參考曲線和測(cè)試曲線各自曲線擬合參數(shù)之間比值的置信區(qū)間，并建立了一個(gè)模板(Figure5)包含了這些計(jì)算和概率閾值設(shè)定0.1(90%置信度)，可做相應(yīng)調(diào)整。為了判定參考曲線和測(cè)試曲線之間是否平行，需要將計(jì)算的置信區(qū)間與一定置信水平的固定置信區(qū)間進(jìn)行比較；在此模板中，使用90%的置信水平，因此，計(jì)算的置信區(qū)間如果落在0.9~1.1之間，那么這兩曲線將被認(rèn)定為平行。

對(duì)于線性擬合曲線，該測(cè)試會(huì)針對(duì)參考曲線和測(cè)試曲線的斜率值進(jìn)行，也即 SoftMaxPro 軟件中所描述的曲線方程內(nèi)的 B 參數(shù)值�？墒牵瑢�(duì)于非線性擬合曲線，此方法只測(cè)試上平臺(tái)和斜率值，下平臺(tái)則由于菲勒定理的數(shù)學(xué)局限而不做測(cè)試。在低濃度時(shí)，參數(shù)的變異會(huì)非常高，導(dǎo)致中間計(jì)算過程會(huì)產(chǎn)生虛數(shù)，進(jìn)而導(dǎo)致最終計(jì)算的置信區(qū)間不正確或無法計(jì)算。這個(gè)問題被美國(guó)農(nóng)業(yè)部 (USDA) 的獸用生物制品中心建議將下平臺(tái)值固定為 0，然后使用上平臺(tái)和斜率值來進(jìn)行測(cè)試。相同地，SoftMax Pro 軟件的 Parallelism Test 的模板內(nèi)，默認(rèn)將下平臺(tái)值設(shè)為 0，然后對(duì)斜率( 參數(shù)B ) 和作為上平臺(tái)的參數(shù) A 或 D 進(jìn)行平行性結(jié)論的判斷。

結(jié)論

眾多的生物學(xué)實(shí)驗(yàn)都需要兩條劑量效應(yīng)曲線對(duì)的平行性進(jìn)行判斷，本應(yīng)用文章介紹了如何使用F-檢驗(yàn)和卡方檢驗(yàn)的效應(yīng)比較法以及費(fèi)勒定理描述的參數(shù)比較法進(jìn)行平行線分析。SoftMax Pro 7軟件中，可以選擇使用約束性和非約束性曲線擬合模型以及高級(jí)的統(tǒng)計(jì)學(xué)公式計(jì)算分析。同時(shí)SoftMaxPro7軟件中，還提供預(yù)存的建立好的每種方法的模板供用戶調(diào)用，輕松進(jìn)行本來很復(fù)雜的平行線分析。

References

1. Gottschalk, P.D. and Dunn, J.R. 2005. Measuring parallelism, linearity, and relative potency in bioassay and immunoassay data. Journal of Biopharmaceutical Statistics 15(3): 437-463.
2. Bates D. M. and Watts D. G. 1988. NonLinear Regression Analysis and its Applications. New York, Wiley.
3. Draper, N. R. and Smith H. 1998. Applied Regression Analysis. 3rd Ed. New York, Wiley.
4. Buonaccorsi, J. P. 2005. Fieller’ s Theorem.In: Armitage, P., Colton, T., editors. Encyclopedia of Biostatistics. 2. Vol. 3. New York, Wiley.
5. United States Department of Agriculture Center for Veterinary Biologics Standard Operating Policy/Procedure. 2015. Using Software to Estimate Relative Potency. USDA Publication No. CVBSOP0102.03. Ames, IA.