簡介

在過去的五年中，熒光蛋白在監(jiān)測體內(nèi)生物學(xué)研究中，起到越來越重要的作用。源于維多利亞多管發(fā)光水母中的綠色熒光蛋白(GFP)是最早被我們應(yīng)用的熒光蛋白，但是隨著時間的推移，現(xiàn)在我們可以使用的熒光蛋白種類也越加豐富，包括加強型的變異GFP蛋白、從其他種類水母中發(fā)現(xiàn)的熒光蛋白和珊瑚礁蛋白。它們都可以在眾多的細胞和組織中被克隆復(fù)制，從細菌到酵母，從植物到哺乳動物。這些熒光蛋白穩(wěn)定、細胞毒性小、而且不需要額外的輔助也能在體內(nèi)產(chǎn)生可見的熒光。因此，它們可以被用作分子靶標或者獨立的報告因子去視化、追蹤和定量多種不同的細胞進程，包括細胞合成與代謝，蛋白轉(zhuǎn)運，基因誘導(dǎo)和細胞譜系。不同的熒光蛋白具有不同的顏色，因此也可被用于多重檢測。這些熒光蛋白都能被熒光顯微鏡和流式細胞儀檢測到。但是相應(yīng)的，如果我們不做細胞分選或監(jiān)測細胞內(nèi)遷移，具有熒光功能的微孔板讀板機將是一個更好、更方便和更高通量的選擇。下面，我們將會向大家展示Molecular Devices微孔板讀板機如何利用“無創(chuàng)”技術(shù)檢測活細胞熒光蛋白。我們將從Clontech公司獲得的三株HEK-293細胞系進行不同熒光蛋白的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。這次研究的目的：1）優(yōu)化三株細胞系的波長設(shè)置，2）通過稀釋細胞系來確定檢測下限LLD，3）證明在一種細胞系中識別另一種細胞系的可行性。

優(yōu)勢

- 簡單易用的“無創(chuàng)”技術(shù)檢測活細胞中熒光蛋白
- 隨意可調(diào)設(shè)置針對每種染料優(yōu)化最佳波長組合
- 熒光底讀檢測獲得最優(yōu)結(jié)果

材料

- HEK-293細胞系穩(wěn)定表達三種熒光蛋白：
- AcGFP-多管發(fā)光水母中產(chǎn)生的另一種GFP(但不同于維多利亞水母)
- ZsGreen-與GFP相似，但更(來自珊瑚礁)
- DsRed-一種來自珊瑚礁的紅色熒光蛋白
- 非轉(zhuǎn)染的HEK-293細胞系，作為對照
- DME: High Glucose(Irvine Scientific cat. #9024)
- G418: Geneticin(Gibco cat. #11811-031)
- FBS (Irvine Scientific cat. #3000A)
- Glutamine/Pen/Strep Solution(Gibco cat. #10378-016)
- Trypsin/EDTA 1X in HBSS(Irvine Scientific cat. #9341)
- 10X Hank’s Balanced Salt Solution(Gibco cat. #14065-056)
- 1M HEPES(Irvine Scientific cat. #9319)
- HBSS Buffer (1X Hank’s Balanced Salt Solution with 20 mM HEPES buffer): Made from 10X Hank’s Balanced Salt Solution (100 mL), 1M HEPES (20 mL) and water for cell culture (880 mL)
- 細胞培養(yǎng)用水(Irvine Scientific cat. #9312)
- 黑色透明平底96孔板(Corning cat. #3603)或黑色透明平底384孔板（Corning cat. #3712）

方法

細胞準備與分析

細胞都培養(yǎng)在大燒瓶中，應(yīng)用含10%FBS+1%Pen/Strep/L-glutamine+500μg/mLG418的DMEM的培養(yǎng)基。沒有轉(zhuǎn)染的HEK-297細胞作為對照。在實驗前一夜，對細胞進行胰酶消化，然后進行密度梯度稀釋，最終密度范圍為從500,000到100個細胞每毫升。然后把它們過夜接種到96孔(100ul)和384孔(25ul)板中。因此，接種的細胞密度就是50,000到10個細胞每孔(96孔板)和12,500到2.5個細胞每孔(384孔板)。每個稀釋都做12個重復(fù)。第二天分別用SpectraMaxM5和GeminiEM兩臺儀器對微孔板進行底讀和頂讀檢測。

波長優(yōu)化

SpectraMax M5和Gemini EM都是基于單色器的掃描式具有熒光功能的微孔板讀板機。針對每一個特殊熒光染料，其激發(fā)波長和發(fā)射波長都可以在背景之上進行信號優(yōu)化，這點也是濾光片式微孔板讀板機所不具備的�？偟膩碚f，優(yōu)化策略就是：用低于理論最大激發(fā)波長20-25nm的激發(fā)光激發(fā)，然后初掃發(fā)射波長；其次用高于理論最大發(fā)射波長20-25nm的發(fā)射光掃激發(fā)波長。掃描后將給出實際的激發(fā)與發(fā)射波長。最后可以結(jié)合信號/背景分析再做其他額外的掃描來確定最終的結(jié)果。(根據(jù)斯托克頓位移理論，激發(fā)波長應(yīng)該更低、發(fā)射波長應(yīng)該更高，并且需要一個發(fā)射光阻隔濾片來隔離掉非目的波長的光信號)。而且可能還會因為要選擇最佳阻隔濾片而再進行兩次掃描。

結(jié)果

波長優(yōu)化

用GeminiEM對DsRed進行波長掃描，以此舉例如何進行波長優(yōu)化。為了檢測最大激發(fā)波長，我們首先固定發(fā)射波長為600nm，然后對發(fā)射波長進行掃描。掃描結(jié)果顯示最大激發(fā)波長為556nm(圖1)。同樣為了檢測最大發(fā)射波長，我們固定激發(fā)波長為535nm，然后掃描發(fā)射波長，從而得到584nm的結(jié)果(圖2)。激發(fā)與發(fā)射值都與被發(fā)表的波長結(jié)果557/579相近。

下一步就是要結(jié)合信號/背景優(yōu)化結(jié)果確定最佳激發(fā)和發(fā)射波長。因為初步檢測結(jié)果的斯托克位移偏小(22nm)，顯然是要通過降低激發(fā)波長和增大發(fā)射波長來擴大兩者之間的差異，其次還需要找到合適的發(fā)射光阻隔濾片優(yōu)化最佳靈敏度。最終，我們使用550nm的激發(fā)波長來激發(fā)，同時使用570nm的發(fā)射光阻隔濾片隔離掉不想要的高于570nm以上的激發(fā)光。通過575到600nm的發(fā)射波長掃描DsRed轉(zhuǎn)染的細胞，結(jié)果顯示在587-588nm處會有峰值出現(xiàn)(圖3，上面的曲線)。背景(沒有轉(zhuǎn)染的細胞)區(qū)域中，點就相對比較平緩(圖3，下面的曲線)�；�于本次掃描，我們最終優(yōu)化的設(shè)置為550nm激發(fā)、588nm發(fā)射、575nm作為發(fā)射光阻隔濾片。

觀察到的最大值與我們建議用于定性分析的設(shè)置都總結(jié)在列表1中。

細胞稀釋的結(jié)果

采用底讀得到的細胞稀釋結(jié)果詳見圖4(96孔板)和圖5(384孔板)。頂讀結(jié)果詳見圖6(96孔板)和圖7(384孔板)。ZsGreen細胞系(上面的曲線)的亮度是其它兩種細胞系的將近3.5倍。盡管DsRed細胞系的結(jié)果暗于ZsGreen，但兩種細胞系的檢測靈敏度卻相近(列表2的下圖)，因為背景值低于DsRed的波長�？偟膩碚f，圖中的點稍微有些非線性，最上方會有一點下降。我們推斷是因為細胞在高濃度時，會有貼壁生長的趨勢，所以會造成非線性的結(jié)果。

列表2給出了所有細胞系確認得到的檢測下限LLD。其中LLD的計算方法是：3*SDBLANK/Slope，SDBLANK是背景孔(沒有細胞的培養(yǎng)基)的標準差，Slope是曲線底部的斜率。(對于96孔板和384孔板，分別使用了10,000個細胞每孔和2500個細胞每孔的數(shù)據(jù))。非轉(zhuǎn)染細胞的RFU信號和標準差結(jié)果都與只含有培養(yǎng)基的結(jié)果相似。

在本次實驗中，ZsGreen和DsRed細胞系在底讀模式都有著相似的檢測限，而且兩者都比AcGFP細胞系的檢測下限低3到4倍。本次實驗一共重復(fù)了三次，但是DsRed實驗結(jié)果并不是每次都能表現(xiàn)的足夠好。在一次實驗中，它的檢測下限近似于AcGFP，但是在另一次實驗中，它的檢測下限又會很高。我們將這些區(qū)別歸結(jié)于不同細胞系的通道數(shù)目不同。(伴隨著一個成功的通道，細胞就會變得越暗)DsRed細胞系在實驗開始階段比其它細胞系長得快，所以在第一次實驗中，它比其它細胞系多2-4倍的通道，結(jié)果就顯然不夠理想。

對于AcGFP和ZsGreen細胞系，當采用頂讀時，檢測下限升高將近三倍。另一方面，對于DsRed，當采用頂讀時，檢測下限會升高將近10-20倍。我們認為造成這種靈敏度下降的原因在于DMEM培養(yǎng)基有紅色熒光信號，會對結(jié)果有內(nèi)部干擾。事實也證明，將培養(yǎng)基換成無色的HBSS，相應(yīng)的DsRed的頂讀結(jié)果也會變好。列表3展示了將有色培養(yǎng)基換成無色培養(yǎng)基的結(jié)果。底讀并沒有太多改變(盡管AcGFP的檢測下限看起來改善了)，證明這種操作方法并沒有導(dǎo)致細胞的損失。然而頂讀結(jié)果卻讓靈敏度改善了將近三倍。這些結(jié)果也從某一方面支持了一種理論，那就是有色培養(yǎng)基會一定程度上影響頂讀的靈敏度。

細胞混合結(jié)果

在本次實驗中，我們在一個96孔板里混合了多種細胞，保證每個孔大約50,000個細胞。因此，如果是1:1混合，那么每種細胞會有25,000個。如果是1:1:1混合，那么每種細胞將有16,700個。實驗板分別用480/510nm(AsGFP和ZsGreen的優(yōu)化結(jié)果)和550/588nm(DsRed設(shè)置)的激發(fā)和發(fā)射來檢測。觀察到的RFU值與預(yù)測值接近。結(jié)果總結(jié)如下。結(jié)果顯示，AsGFP和ZsGreen可以和DsRed一起檢測，反之亦然。(見圖表4)

結(jié)論

Molecular Devices公司的熒光功能微孔板讀板機可以檢測完整貼壁細胞中的熒光蛋白。波長掃描可調(diào)的功能可以優(yōu)化每一種獨特?zé)晒馊玖系牟ㄩL結(jié)果。底讀模式提供最佳檢測靈敏度，頂讀模式也可以提供可利用的數(shù)據(jù)，尤其是對含有ZsGreen和DsRed的細胞系。

頂讀模式檢測DsRed細胞系時，可以通過替換無色培養(yǎng)基來達到優(yōu)化實驗結(jié)果的目的。