前言

炎癥反應(yīng)的一個(gè)重要步驟是細(xì)胞表面抗原與血管中免疫細(xì)胞的特異性結(jié)合。因此，對這些分子變化的及時(shí)監(jiān)控，如VCAM,E-selectin，以及內(nèi)皮細(xì)胞上的HLADR等等，可以為細(xì)胞水平的炎癥模型提供有效的生理指標(biāo)上的支持。

我們用多通道熒光讀取人原代細(xì)胞表面的炎癥標(biāo)記，并在此基礎(chǔ)上評估不同介質(zhì)對炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用。例如，在用炎癥因子(TNF或者IFN)刺激原代內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)后，細(xì)胞表面的炎癥標(biāo)記表達(dá)可以通過檢測與之結(jié)合的預(yù)染抗體的總熒光強(qiáng)度來定量。

我們在多個(gè)指標(biāo)如增加組間差異，重復(fù)性和通量上對IsoCyte掃描細(xì)胞計(jì)數(shù)儀和SpectraMax®M5微孔板讀板機(jī)進(jìn)行了比較。多通路的讀值在檢驗(yàn)抗炎化合物的有效性和毒性的同時(shí)，還可以通過選擇性抑制不同信號(hào)通路激活的炎癥標(biāo)記來深入的研究相關(guān)機(jī)制。

炎癥實(shí)驗(yàn)

用炎癥因子（TNF, IFN；R&D）刺激HUVEC細(xì)胞（lonza）24h。用BD 公司說明書推薦的方法，利用預(yù)染抗體和粘附分子的特異性結(jié)合對細(xì)胞進(jìn)行染色標(biāo)記。
選擇的抗體包括：

PE-conjugated anti-CD106 (VCAM),
APC conjugated anti E selectin
APC-conjugated anti-HLA-DR
AF488-conjugated anti-CD31（PECAM）

方法

熒光檢測炎癥標(biāo)記

演示中的IsoCyte-DL 掃描細(xì)胞計(jì)數(shù)儀 平臺(tái)配置了20mW 488nm和40mW 640nm的激光器。488nm的激光器配套510-540nm的帶通(bp)濾光片(Ch1)可用于檢測Alexa Fluor®488(AF488)標(biāo)記的細(xì)胞；Phycoerythrin標(biāo)記細(xì)胞的檢測則需要配560-610nm bp的濾光片(Ch3)；APC的檢測需要640nm的激發(fā)和660-720nm的發(fā)射濾光片。圖像的獲取是通過5*5的微米采樣，在5min內(nèi)對96孔或者384孔板完成掃描。

SpectraMax® M5 多孔板讀板機(jī)包含的488nm激發(fā)和530nm散射(二向色鏡 515nm)可以檢測Alexa Fluor®488標(biāo)記的細(xì)胞，590nm(二向色鏡550nm)可以檢測Phycoerythrin標(biāo)記細(xì)胞。

結(jié)果和討論

用SpectraMax® M5 檢測炎癥標(biāo)記的表達(dá)

抗炎化合物抑制黏附分子

潛在抗炎化合物比較

多通路炎癥實(shí)驗(yàn)

高通量實(shí)驗(yàn)評估抗炎化合物效力

總結(jié)

- 我們通過檢測標(biāo)記抗體與粘附分子的結(jié)合，可以有效的評估抗炎化合物的效能。
- 我們已經(jīng)測試了多種炎癥因子和抗炎藥物組合對HUVEC細(xì)胞的不同處理?xiàng)l件下，細(xì)胞炎癥標(biāo)記，如VCAM,E-selectin，HLA-DR,CD31的表達(dá)水平。
- 運(yùn)用多通道的IsoCyte 或 SpectraMax® M5可以有效監(jiān)測炎癥標(biāo)記的上調(diào)和下調(diào)。
- 我們的數(shù)據(jù)包括利用3種已知的抗炎化合物：AG126，SB202190和PDTC來評估抗炎分子的效力。
- 在高通量兼容模式下，我們可以在96孔和384孔板水平上用多通路炎癥實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)抗炎化合物的效力。