高鹽飲食對(duì)更年期焦慮小鼠海馬鉀離子 - 氯離子共轉(zhuǎn)運(yùn)體 2、鈉 - 鉀 - 氯離子失轉(zhuǎn)運(yùn)體 1 表達(dá)的影響

【摘 要】目的 研究高鹽飲食對(duì)更年期焦慮癥小鼠鉀離子-氯離子共轉(zhuǎn)運(yùn)體 2( KCC2) 、鈉-鉀-氯離子共轉(zhuǎn)運(yùn)體 1( NKCC1) 表達(dá)的影響。方法 將大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、4% 高鹽飲食組、8% 高鹽飲食組。其中 4% 高鹽飲食組、8% 高鹽飲食組經(jīng)高鹽飲食干預(yù) 1個(gè)月后，HE 染色觀察腦部結(jié)構(gòu)，免疫組織化學(xué)觀察 KCC2、NKCC1 表達(dá)情況。結(jié)果 高鹽飲食使更年期焦慮小鼠海馬區(qū)錐體細(xì)胞排列紊亂，神經(jīng)元數(shù)目明顯減少，細(xì)胞輪廓模糊，出現(xiàn)大量的空泡現(xiàn)象，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞間隙明顯增大; 模型組 KCC2 表達(dá)的陽性細(xì)胞明顯減少，高鹽飲食組陽性細(xì)胞極少; 模型組 NKCC1表達(dá)陽性細(xì)胞明顯增多，高鹽飲食組陽性細(xì)胞增多更明顯。結(jié)論 高鹽飲食加重更年期焦慮癥的發(fā)生可能與 KCC2 及 NKCC1 之間的動(dòng)態(tài)平衡被打破有關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕 高鹽飲食; 更年期焦慮癥; 鉀離子-氯離子共轉(zhuǎn)運(yùn)體 2; 鈉-鉀-氯離子共轉(zhuǎn)運(yùn)體 1

更年期焦慮癥不僅影響患者的健康、社會(huì)關(guān)系、家庭生活等方面，還可引起其他精神障礙疾病，甚至產(chǎn)生自殺行為，且直接關(guān)系到老年期疾病的發(fā)生。因此其防治研究是臨床醫(yī)護(hù)人員乃至整個(gè)社會(huì)所面臨的重要任務(wù)。隨著年齡增長，人們味覺功能下降，在日常生活中表現(xiàn)為食物咸味重，研究表明我國人均吃鹽及人均每天食鹽攝入量均超標(biāo)。本研究探討高鹽飲食對(duì)更年期焦慮小鼠鉀離子-氯離子共轉(zhuǎn)運(yùn)體 2( KCC2) 、鈉-鉀-氯離子共轉(zhuǎn)運(yùn)體 1( NKCC1) 的影響。

1 材料與方法

1. 1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選用 11 月齡的昆明雌性小鼠，清潔級(jí)，體重35 ～ 45 g，由長沙市開福區(qū)東創(chuàng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技服務(wù)部代購，動(dòng)物合格證號(hào): scxk( 湘) 2009-0012。飼料均來自于由長沙市開福區(qū)東創(chuàng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技服務(wù)部。

1. 2 試劑與儀器 羊抗鼠 KCC2、NKCC1 多克隆抗體購自美國Sigma公司。低溫大容量高速離心機(jī)( 型號(hào): KDC-2046 低溫大容量離心機(jī)，中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)科技實(shí)業(yè)有限公司) ; 電子天平( 型號(hào): ES-C-600 電子天平，湘儀天平儀器有限公司) 。

1. 3 分組 連續(xù) 5 d 進(jìn)行小鼠陰道涂片檢查，呈現(xiàn)不規(guī)則動(dòng)情周期的小鼠為自然更年期小鼠。將 40 只更年期小鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、4% 高鹽飲食組、8% 高鹽飲食組。分組后空白組和模型組小鼠繼續(xù)給予普通飼料，4% 高鹽飲食組小鼠予含 4% 的 Na Cl 高鹽顆粒飼料，8% 高鹽飲食組小鼠予含 8% 的Na Cl 高鹽顆粒飼料喂養(yǎng)，自由攝食，自由飲用自來水，連續(xù) 1個(gè)月。

1. 4 實(shí)驗(yàn)儀器 ①高架十字迷宮模型②明暗箱③曠場實(shí)驗(yàn)均由上海欣軟信息科技有限公司提供。

1. 5 HE 染色 實(shí)驗(yàn)第 31 天取材，麻醉灌注取腦，4% 多聚甲醛固定，石蠟包埋，常規(guī) HE 染色，脫水透明封固，制成切片，光學(xué)顯微鏡觀察。

1. 6 免疫組織化學(xué) 實(shí)驗(yàn)第 31 天取材，麻醉灌注取腦，4% 多聚甲醛固定，經(jīng)脫水、透明、包埋，選擇海馬部位冠狀位連續(xù)冷凍切片。以 SABC 法 進(jìn) 行 免 疫 組 織 化 學(xué): 加 入 0. 3% H2O210 min，3% 正常山羊血清封閉 10 min; 滴加一抗( 1 ∶ 100) ，過夜( 陰性對(duì)照組以正常羊血清替代一抗) ，加入羊抗兔 Ig G、SABC，室溫放置 2 h，PBS 沖洗鋪片，DAB 顯色劑顯色，脫水，封片。每只大鼠取 3 張切片，每張切片選取 3 個(gè)無重疊在顯微鏡( ×400) 下觀察海馬區(qū) NKCC1、KCC2 的表達(dá)情況。

1. 7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 組間比較行 t 檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2. 1 高鹽飲食對(duì)更年期焦慮癥小鼠腦部結(jié)構(gòu)的影響

空白組海馬區(qū)細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞核圓而大，核仁清晰可見，錐體細(xì)胞排列整齊，層次緊密; 模型組海馬區(qū)錐體細(xì)胞排列較紊亂，神經(jīng)元數(shù)目減少，細(xì)胞輪廓較清晰，出現(xiàn)空泡現(xiàn)象，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞間隙相對(duì)增大; 高鹽飲食組海馬區(qū)錐體細(xì)胞排列紊亂，神經(jīng)元數(shù)目明顯減少，細(xì)胞輪廓模糊，出現(xiàn)大量的空泡現(xiàn)象，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞間隙明顯增大，8% 高鹽飲食組表現(xiàn)比 4%高鹽飲食組更明顯。

2. 2 高鹽飲食對(duì)更年期焦慮癥小鼠腦海馬 KCC2 表達(dá)的影響

在高倍光學(xué)顯微鏡下，觀察細(xì)胞陽性著色情況，與空白組比較，模型組 KCC2 表達(dá)陽性細(xì)胞明顯減少，高鹽飲食組陽性細(xì)胞極少，且 4% 和 8% 高鹽組之間沒有明顯的差異。

2. 3 高鹽飲食對(duì)更年期焦慮癥小鼠腦海馬 NKCC1 表達(dá)的影響

在高倍光學(xué)顯微鏡下，觀察視野范圍內(nèi)細(xì)胞陽性著色情況，與空白組比較，模型組 NKCC1 表達(dá)陽性細(xì)胞明顯增多，高鹽飲食組陽性細(xì)胞增多更明顯，但 4% 和 8% 高鹽組之間沒有明顯的差異。

討 論

合理的飲食結(jié)構(gòu)是現(xiàn)代中醫(yī)護(hù)理中飲食護(hù)理的中心內(nèi)容之一。目前提倡合理的飲食結(jié)構(gòu)，雖根據(jù)每個(gè)人的機(jī)體狀況而有所不同，但總體而言首先應(yīng)避免偏嗜。早古代醫(yī)家就已強(qiáng)調(diào)飲食不宜過咸，應(yīng)少吃鹽�，F(xiàn)代文獻(xiàn)也報(bào)道食物與人的情緒有關(guān)，如多食咸味、甘味，使鹽、糖攝入過多，情緒容易激動(dòng)。澳大利亞學(xué)者曾歷時(shí) 10 年的跟蹤調(diào)查結(jié)果顯示，飲食結(jié)構(gòu)與抑郁、焦慮等精神紊亂之間存在密切的關(guān)系。KCC2 分布于神經(jīng)元細(xì)胞膜上的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，是神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)氯離子外排的主要因素，使 Cl－由細(xì)胞內(nèi)移向細(xì)胞外，降低胞內(nèi)的 Cl－濃度; NKCC1 分布于上皮細(xì)胞和非上皮細(xì)胞膜上，則順著內(nèi)向 Na 梯度促使 Cl－由細(xì)胞外移向細(xì)胞內(nèi)，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)Cl－堆積，故 Cl－排出系統(tǒng)( KCC2) 及 Cl－聚集系統(tǒng)( NKCC1) 之間的動(dòng)態(tài)平衡決定中樞神經(jīng)系統(tǒng)中〔Cl－〕i。γ-氨基丁酸( GA-BA) 產(chǎn)生興奮性和抑制性作用之間的進(jìn)行轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵因素在神經(jīng)元細(xì)胞 內(nèi) Cl－濃 度 差，而 功 能 相 反 的 氯 離 子 共 轉(zhuǎn) 運(yùn) 體KCC2 / NKCC1 是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)調(diào)節(jié) Cl－濃度差、調(diào)控 GABA效應(yīng)轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵因素。研究表明，KCC2 基因敲除的大鼠，其腦內(nèi) GABA 的抑制作用下降。NKCC1 mＲNA 表達(dá)增高及KCC2mＲNA 表達(dá)降低的變化可能引起神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi) Cl－濃度增高，Cl－梯度的崩潰，Cl－內(nèi)流減少，細(xì)胞膜超級(jí)化減弱，從而導(dǎo)致 GABA 能抑制作用的減弱，神經(jīng)元高興奮性，使癲癇易感性增加。課題研究前期采用 EPM、高架十字迷宮成功制備焦慮癥模型，且高鹽飲食可加重動(dòng)物焦慮程度，減少其活動(dòng)次數(shù)，本研究結(jié)果顯示高鹽飲食加重更年期焦慮癥的發(fā)生可能與高鹽飲食使細(xì)胞內(nèi)外的 Na+、Cl－水平發(fā)生改變，KCC2 及NKCC1 之間的動(dòng)態(tài)平衡被打破，但具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。