聯(lián)合服用色氨酸對氟西汀治療抑郁模型大鼠抑郁、焦慮樣行為的影響

【摘要】 目的探討聯(lián)合服用色氨酸對氟西汀治療抑郁模型大鼠抑郁、焦慮樣行為的影響。方法將60只雄性Wistar大鼠按隨機區(qū)組法分為對照組、色氨酸組、氟西汀組和色氨酸+氟西汀組，各15只。對照組大鼠給予9 g／L氯化鈉注射液灌胃(5 mtAg)，色氨酸組給予50 mg／kg色氨酸，氟西汀組給予10 mg／kg氟西汀，色氨酸+氟西汀組同時給予大鼠50 mg／kg色氨酸和10 mg／kg氟西汀灌胃。4組大鼠均給予21 d長期慢性、中等和不可預(yù)知應(yīng)激刺激建立抑郁模型。采用改良強迫游泳實驗檢測4組大鼠靜止不動時間、游泳時間及攀爬時間。采用高架十字迷宮實驗檢測4組大鼠進入開放臂、閉合臂時間，進入中央?yún)^(qū)時間及進入開放臂次數(shù)占總次數(shù)百分比。高效液相色譜法測定4組大鼠腦脊液中色氨酸水平。 結(jié)果 (1)4組大鼠靜止不動時間、游泳時間、攀爬時間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0．05)。氟西汀和色氨酸均對大鼠改良強迫游泳實驗行為學(xué)指標有顯著影響。(2)4 組大鼠進入開放臂時間、進入閉合臂和中央?yún)^(qū)的時間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義釁0．05)。氟西汀對大鼠高架十字迷宮實驗行為學(xué)指標有顯著影響。色氨酸對大鼠進入各臂與中央?yún)^(qū)的次數(shù)、時間無顯著影響。氟西汀和色氨酸聯(lián)用對大鼠高架十字迷宮實驗行為學(xué)指標的影響不存在顯著交互作用。(3)4組大鼠腦脊液中色氨酸水平測定結(jié)果差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F_6．874，P=-O．002)。色氨酸+氟西汀組大鼠腦脊液中色氨酸水平顯著高于對照組及色氨酸組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(氏0．05)。 結(jié)論(1)色氨酸可加重大鼠抑郁樣行為，對焦慮行為無明顯作用；(2)氟西汀可逆轉(zhuǎn)大鼠抑郁樣行為，但致焦慮；(3)色氨酸和氟西汀聯(lián)合使用對治療大鼠焦慮樣行為、抑郁樣行為無明顯效果。

【關(guān)鍵詞】色氨酸； 氟西�。灰钟�；焦慮； 交互作用

抑郁癥是一種以顯著而持久情緒低落為特征的情感性精神障礙，具有高患病率、高復(fù)發(fā)率、高致殘率和高自殺率特點，嚴重危害著人類身心健康。研究表明5一羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)是情緒性行為的重要調(diào)節(jié)因子，其功能異常可能參與抑郁癥發(fā)病機制。目前。選擇性5-HT重吸收抑制劑(SSRIs)，如氟西汀等，是治療抑郁癥的首選藥物；但這類藥物療效不佳、治療周期長、副反應(yīng)多和復(fù)發(fā)率高。因此，亟待開發(fā)新型抑郁癥防治藥物。近年來研究表明口服色氨酸可增加5-HT的合成．促進5-HT能系統(tǒng)功能的恢復(fù)。故本研究通過觀察抑郁模型大鼠服用色氨酸聯(lián)合氟西汀后的行為與生化變化以探討色氨酸聯(lián)合氟西汀治療抑郁的療效。

材料與方法

一、實驗動物與試劑、儀器

健康成年雄性Wistar大鼠60只，8周齡，體質(zhì)量230—280 g，由華北煤炭醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。分籠飼養(yǎng)，室溫(22±1)℃，濕度(55±5)％，光暗周期12／12h，可自由攝食、飲水。大鼠于實驗前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。按隨機區(qū)組法將大鼠分為對照組、色氨酸組、氟西汀組和色氨酸+氟西汀組，各15只。L．色氨酸購自上�？颠_氨基酸廠：鹽酸氟西汀原料藥購自西安萬昌生物科技有限公司；SupelcosilLC．18色譜柱(250 mmx4．6 mnl，5斗m)購自上海楚定分析儀器有限公司；Eppendorf5408R型臺式高速冷凍離心機購自德國Eppendorf公司。

二、抑郁模型大鼠的建立

給予4組大鼠21 d長期慢性、中等和不可預(yù)知應(yīng)激刺激，包括電擊足底(電壓40V，20 s／次，間隔50 S，共20次)、熱應(yīng)激(45℃，5 min)、冰水游泳(4℃，5 min)、夾尾(1 min)、晝夜顛倒、禁食(48 h)、禁水(24 h)。每日隨機給予一種刺激，且相同刺激不可連續(xù)出現(xiàn)。

三、給藥方法

刺激期間同時給予大鼠灌胃給藥，每日1次，連續(xù)42 d。對照組大鼠給予9 g／L氯化鈉注射液(5mE&g)灌胃，色氨酸組給予50 mg／kg色氨酸，氟西汀組給予10 mg／kg氟西汀，色氨酸+氟西汀組同時給予大鼠50 mg／kg色氨酸和10 mg／kg氟西汀灌胃。

四、行為學(xué)指標觀察

1．改良強迫游泳實驗（上海欣軟公司提供）：連續(xù)灌胃給藥42 d后，將大鼠禁食12 h后置于底部直徑21 cm、高50 cm的透明圓柱形游泳桶中，水溫(25±1)℃，水深30cm，強迫游泳15 min后將其從泳池中取出．擦干并放回飼養(yǎng)籠。24 h后，將大鼠再次置于游泳桶中，連續(xù)觀察并錄像5 min，分析大鼠靜止不動、游泳和攀爬的時間。

2．高架十字迷宮實驗（上海欣軟公司提供）：末次給藥后第2天進行實驗。裝置由2條相對閉合臂(50 cm×10 cm)和2條相對開放臂(50 cm×10 cm)連接組成一個帶有中央?yún)^(qū)(10 cmxl0 cm)的方形結(jié)構(gòu)，4條臂均為黑色．距離地面43 cm。將大鼠置于安靜、黑暗的敞箱中自由活動5 min，隨后將其從中央?yún)^(qū)面向開放臂放入．連續(xù)觀察5 min，記錄進入開放臂時間、次數(shù)及進入閉合臂時間、次數(shù)等資料。

五、腦脊液樣本采集

首次給藥4 h后，大鼠腹腔注射20％烏拉坦(1．2g／kg)麻醉，俯臥置于動物固定架上，在大鼠的枕骨大孔正中線上，順平行其頭部彎曲的角度，將1 mL注射器刺入其小腦延髓池，吸取50～60汕L腦脊液，10 000xg離心5 min。取上清保存于一70℃環(huán)境中。

六、高效液相色譜法測定色氨酸濃度

腦脊液樣品用鄰苯二甲醛衍生化反應(yīng)后．采用高效液相色譜法分離。色譜柱為Supelcosil LC一18(250 mmx4．6 mm，5¨m)，流動相A為0．04 mol／L一水磷酸二氫鈉(pH5．5)，含20％(體積百分比)甲醇；流動相B為0．01 mol／L一水磷酸二氫鈉(pH5．5)，含80％(體積百分比)甲醇；用二元梯度洗脫，流速1．4mL／min，柱溫24℃，進樣量50斗L。熒光檢測器激發(fā)波長360 nln，發(fā)射波長455 nlTI，以外標法定量。

七、統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSSl3．0統(tǒng)計學(xué)軟件進行分析。計量資料以均數(shù)±標準差6蜘)表示。采用單因素方差分析法對大鼠行為學(xué)指標和腦脊液色氨酸水平進行統(tǒng)計學(xué)分析。若色氨酸和氟西汀抗大鼠抑郁、焦慮樣行為的療效存在顯著交互作用，則進行ANOVA簡單效應(yīng)檢驗，組間比較采用LSD．t法；若交互作用不顯著，則采用獨立樣本t檢驗比較色氨酸+氟西汀組與對照組差異。當P<0．05時認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

討論

5-HT為中樞神經(jīng)系統(tǒng)重要的神經(jīng)遞質(zhì)，參與情緒調(diào)節(jié)、學(xué)習(xí)和記憶。5-HT系統(tǒng)功能低下是抑郁癥發(fā)病的重要機制，色氨酸是5-HT合成的限制因素，色氨酸不能自由通過血腦屏障。需經(jīng)非特異性氨基酸轉(zhuǎn)運體運輸至腦內(nèi)，但外周色氨酸濃度可影響中樞內(nèi)色氨酸的可利用度。因此基于5-HT能系統(tǒng)調(diào)節(jié)情緒和行為的假設(shè)，El服色氨酸可增加腦內(nèi)5-HT水平。本研究觀察聯(lián)合服用色氨酸對氟西汀治療抑郁模型大鼠抑郁、焦慮樣行為的影響。

根據(jù)改良強迫游泳實驗結(jié)果，色氨酸顯著增加大鼠靜止不動時間，減少攀爬時間，同時顯示出減少游泳時間的趨勢，因此具有加重大鼠抑郁樣行為的作用，這可能與色氨酸使用劑量有關(guān)。當色氨酸濃度未達到需要時可限制5-HT合成，導(dǎo)致腦內(nèi)5一HT水平無法增加海馬神經(jīng)前體細胞或加強神經(jīng)元再生，抑郁加重。研究表明，色氨酸攝入受限將增加大鼠在改良強迫游泳實驗中靜止不動時間。且這種抑郁樣行為可能與5-HT能系統(tǒng)活性降低有關(guān)。本研究結(jié)果也顯示．在不限制飲食且不消耗內(nèi)源性5-HT的情況下．大鼠口服色氨酸對5-HT能系統(tǒng)活性無正面效應(yīng)。氟西汀顯著減少靜止不動時間，增加游泳時間．具有逆轉(zhuǎn)大鼠抑郁樣行為的作用，這與其可抑制突觸前膜對5一HT的再攝取，增加神經(jīng)細胞突觸間隙5-HT水平．增強其情緒調(diào)節(jié)有關(guān)。

根據(jù)高架十字迷宮實驗結(jié)果，色氨酸對大鼠焦慮行為無顯著作用，而氟西汀則具有致焦慮作用。多數(shù)相關(guān)研究均顯示氟西汀可增加大腦細胞外5-HT水平。本研究關(guān)于氟西汀具有逆轉(zhuǎn)抑郁樣行為以及致焦慮作用的研究結(jié)果，與其他研究者的結(jié)果一致。然而，另一些研究顯示氟西汀具有抗焦慮作用。造成研究結(jié)論與本文不一致的原因可能與給藥劑量不同有關(guān)。根據(jù)這些研究的治療效果．本研究中氟西汀給藥量選擇為10 mg／(kg·d)，屬于較高劑量。目前，有關(guān)色氨酸減緩抑郁的研究尚無一致結(jié)論。聯(lián)合服用色氨酸對氟西汀逆轉(zhuǎn)抑郁樣行為無顯著促進作用。但本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)色氨酸和氟西汀對大鼠靜止不動時間的影響存在一定的交互作用。提示腦脊液中色氨酸水平升高可能抵消了氟西汀逆轉(zhuǎn)抑郁樣行為的作用。此外，聯(lián)合服用色氨酸和氟西汀對大鼠的焦慮行為無顯著改善作用。動物實驗結(jié)果顯示，色氨酸聯(lián)合氟西汀、齊美利定、氯丙咪嗪或阿密曲替林治療對抑郁模型大鼠抑郁、焦慮樣行為的改善作用并不穩(wěn)定。但Cervo等研究顯示。預(yù)先給予色氨酸可使2種耐西酞普蘭的小鼠對西酞普蘭增敏。

本研究發(fā)現(xiàn)單獨服用色氨酸或氟西汀對大鼠腦脊液色氨酸水平無顯著影響；然而，聯(lián)合服用色氨酸和氟西汀大鼠腦脊液中的色氨酸水平較對照組顯著升高。推測與色氨酸和氟西汀對大鼠腦脊液中色氨酸水平的影響存在顯著交互作用有關(guān)。色氨酸經(jīng)色氨酸羥化酶(TPH)轉(zhuǎn)化為5一羥色氨酸(5．HTP)，再經(jīng)5-HTP脫羧酶轉(zhuǎn)化為5-HT。氟西汀不但可增加神經(jīng)細胞間隙的5-HT濃度．同時Shishkina等研究顯示氟西汀可上調(diào)大鼠大腦TPH．2酶mRNA水平，可增加色氨酸非特異性氨基酸轉(zhuǎn)運體的水平，使其運輸至腦內(nèi)濃度增加，因此聯(lián)合用藥時大鼠腦脊液中色氨酸濃度增加。然而。本研究結(jié)果表明色氨酸和氟西汀聯(lián)用在逆轉(zhuǎn)抑郁模型大鼠抑郁方面無協(xié)同作用。推測是由于長期用藥以及改良強迫游泳實驗、高架十字迷宮實驗影響了與5-HT合成以及代謝過程相關(guān)的酶的表達和活性。

綜上所述。聯(lián)合服用色氨酸對氟西汀逆轉(zhuǎn)大鼠抑郁樣行為無顯著促進作用，并且對大鼠焦慮樣行為也無明顯改善作用。